2023-2024外泌体行业发展白皮书

前言 当下，肿瘤创新药发展日新月异，随着以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞疗法、TIL疗法等创新药的陆续获批上市，整个格局呈现出了多样化的发展趋势，各个细分赛道蓬勃发展。 其中，外泌体（exosome）是由细胞多囊泡体（MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。外泌体作为细胞间通讯的重要媒介，具有传递信息、调节细胞功能等关键作用，其组成和功能多样性为疾病诊断、治疗及药物递送提供了全新的视角，为肿瘤免疫治疗领域带来了新的希望，正在引起广大研究者的极大关注。 纯化的“天然”外泌体已在人体中显示出良好的安全性，同时，为了提高外泌体的精准靶向递送和载药物，科学家们正在设计工程化外泌体，通过工程化赋能，外泌体可以实现更高效、更安全的药物递送。 尽管化外泌体在肿瘤治疗中具有巨大的潜力，但外泌体这一赛道还面临许多挑战。外泌体具有异质性，其制备和纯化技术仍需进一步完善；且外泌体非常复杂，外泌体的鉴定和检测尚未形成明确的标准。不过目前国内外已经多诸多企业布局外泌体赛道，国外进展较快的企业包括EVOXTherapeutics、CapricorTherapeutics、DirectBiologics等，国内聚焦外泌体分离、提纯、检测、新药研发、递送、诊断等业务的企业已经超过60家。整体来看，外泌体行业还处于早期发展阶段，不过国内外泌体行业的产业化已经初具雏形，未来发展潜力巨大。 02 目录 前言02 第一章外泌体概述04 1.1外泌体的组成和功能04 1.2外泌体的来源06 1.3常见的分离方法06 1.4外泌体鉴定07 1.5工程化赋能外泌体08 第二章外泌体的应用趋势：从“细胞垃圾”到“明日之星”11 2.1诊断检测11 2.2疾病治疗12 2.3药物递送12 2.4其他应用14 2.5临床转化进展15 第三章外泌体产业化初具雏形，为商业化奠定基础17 3.1外泌体产业化的机遇与挑战17 3.2市场前景可期18 第四章外泌体企业盘点：国外群雄逐鹿，国内高速崛起20 4.1国外领军企业20 4.2国内代表企业23 第六章监管政策37 免责声明39 03 第一章外泌体概述 外泌体（exosome）是由细胞多囊泡体（MVB）与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡，直径约为30-100nm。其天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。 •外泌体于20世纪80年代早期首次在绵羊网织红细胞中被发现； •1987年Johnstone将其命名为“Exosome”； •2013年，细胞内部囊泡运输调控机制获“诺贝尔生理或医学奖”，推动外泌体的研究加速发展； •发展至今，外泌体已经被广泛应用于诊断检测、疾病治疗、药物递送等热门领域。 1.1外泌体的组成和功能 外泌体具有脂质双层膜结构，携带来自不同组织和器官细胞的各种类型的大分子，主要包括蛋白质、核酸和脂类。外泌体中常见的蛋白质有Rabs蛋白、膜联蛋白、四跨膜蛋白、热休克蛋白、多种的代谢类的酶等；核酸则包括microRNA、mRNA、lncRNA、tRNA等；脂类包含鞘磷脂、磷脂酸神经酰胺和胆固醇等。 （外泌体发生、分泌过程及组成，图源：参考资料1） 04 当含有多种内容物的外泌体释放到细胞外后，在组织液中移动到邻近的靶细胞，或在循环中移动到远处的靶细胞，并将信号传递给靶细胞，主要通过以下几种途径： （1）外泌体上的跨膜蛋白直接作用于受体细胞膜表面的信号分子，激活细胞内信号级联； （2）外泌体膜与细胞膜融合，将外泌体的内容物直接送入靶细胞内； （3）外泌体通过吞噬作用或内吞作用进入细胞。 在很长一段时间内，外泌体被认为是细胞排泄废物的一种方式，而随着研究的深入，发现外泌体具有多种多样的功能，其功能取决于其所来源的细胞类型，可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等过程中，发挥不同功能。 （外泌体的功能和作用，图源：参考资料1） 05 1.2外泌体的来源 几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。根据不同生物来源分类，外泌体可分为动物细胞外泌体、植物外泌体、微生物外泌体。哺乳动物中无论是“健康细胞”还是“病理细胞”均可以分泌外泌体。在循环外泌体中，有80-90%来自血小板、淋巴细胞、树突状细胞、其他免疫细胞，通过循环系统到达其他细胞与组织产生远程调控作用。 目前，可通过GMP大规模生产获得的动物细胞外泌体主要包括：牛奶外泌体、人心脏祖细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪干细胞外泌体、树突状细胞外泌体、HEK293细胞外泌体等。 1.3常见的分离方法 为了在研究和临床中更加有效地利用外泌体，从生物样品中精确地将外泌体分离出来至关重要。目前分离外泌体主要有超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、聚合物沉淀法、免疫亲和法、分子排阻色谱法、微流控技术和试剂盒法，这8种方法各有优点和不足。 （1）超速离心法：这是基于溶液中不同物质的沉降系数不同的原理，超速离心法得到的外泌体量多，是最为常用的分离方法之一，但这种方法得到的外泌体纯度不足，整个过程耗时较长且需要昂贵的大型仪器。 （2）密度梯度离心法：通过密度不同的原理可以将外泌体与其他杂质分开，提取的外泌体纯度较高，但过程繁琐，耗时较长而得到的量较少。 （3）超滤法：通过截留不同相对分子质量的超滤膜进行选择性分离，分子小的物质会被过滤到膜的另一侧，该方法便于操作，但外泌体可能会阻塞过滤孔而降低分离效率，不适合含杂质较多的样本。 （4）聚合物沉淀法：高度亲水的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用，形成疏水性微环境，从而导致外泌体沉淀。这种方法分离的外泌体纯度不高，回收率较低，可能会产生难以去除的聚合物。 （5）免疫亲和法：用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合可将外泌体吸附 06 并分离出来，该方法可以获得不同的外泌体亚型，特异性高且操作简便，但其产量较低外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响。 （6）分子排阻色谱法：是利用分子尺寸大小来分离外泌体的色谱分离技术，通过外泌体和其他蛋白质等颗粒大小的不同来分离出高纯度的外泌体。但是该方法耗时较长，不适合大量样本的处理。 （7）微流控技术：这是一种新兴的是基于微小流体的技术，具有分离速度快、纯度高、集成度高等优点，但对大体积样本的处理能力弱且制作工艺复杂。 （8）试剂盒法：市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，无需特殊设备，提取效率和纯化效果较高，操作便捷，不过不同商家的产品纯化效果良莠不齐，不适用于大批量样本的处理。 尽管方法众多，但尚没有一种方法能够解决包括批次间差异、产量低、纯度低在内的所有挑战，目前业内认为，将这些方法交叉结合起来将是改善分离结果的具有前景的策略。 1.4外泌体鉴定 由于分离纯化手段的限制，难以获得纯度高且单一性强的外泌体，因此后续需要通过多种实验来评估外泌体样品的纯度和完整性。目前外泌体的鉴定主要包括电镜成像、粒径检测和WesternBlot检测。 第一章电镜成像：通过透射电子显微镜（TEN）或扫描电子显微镜（SEM）可以直观地观察外泌体形态和大小，但电镜会有背景的干扰，且无法区分外泌体和与其形态相近的粒子。 第二章粒径检测：通过光学原理感知粒子的存在，可以从整体上对外泌体数量和直径的群体特征进行检测，但不能确认外泌体的真实存在和外泌体的完整性，不适用于复杂样品的检测。 第三章WesternBlot检测：采用抗原抗体特异性相结合的原理，可以鉴定外泌体中存在的特定蛋白，能证实外泌体成分的存在，无法确认外泌体的数量和完整性。 上述任何单一的方法都难以精确鉴定，但可以通过三个实验相互佐证来确认外泌体的存在、数量和完整性。 07 1.5工程化赋能外泌体 迄今为止，纯化的“天然”外泌体已在人体中显示出良好的安全性，但有时在临床试验中缺乏足够的功效。首先，这是因为天然外泌体携带的作用性物质完全来源于分泌细胞；其次，外泌体在全身渗透的过程也并非无懈可击，进入体循环后，外泌体必须避开免疫细胞以及肝、肺、肾等排泄器官。同时它们的组织靶向效率也取决于功能化程度以及与靶细胞的相互作用强度。因此，科学家们正在设计工程化外泌体，以包含多种药物“货物”并特异性靶向不同的组织，由此衍生出了诸多工程化外泌体的构建策略。 （工程化外泌体的表面修饰方式，图源：参考资料6） （1）确定目标负载分子的包装方式 确定负载分子的包装方式是指寻找将药物转入天然外泌体内部的方法，以保证药物的有效性和稳定性。这些方法通常被分为两大类：外源性加载和内源性加载。 08 外源性加载： 先将外泌体分离纯化，然后将现有药物（如siRNA和小分子）通过主动或者被动结合方式直接加载到外泌体中。其中被动结合主要通过浓度梯度差将药物扩散到外泌体内，操作相对简单而且可以保持外泌体的形态，但装载效率较低；主动结合方式需要暂时破坏细胞膜，使药物更容易进入外泌体的内部。在药物扩散后，外泌体的膜重新恢复，具体方法包括：电穿孔法、超声方法、挤压法、冻融法、化学转染等。 内源性加载： 这种方式是让生产外泌体的细胞也生产所需的药物，通过药物与大量表达的外泌体蛋白或其片段的遗传关联（例如在细胞内与CD63共表达将目标分子包装进外泌体）来实现加载，经修饰过的细胞分泌的外泌体便含有所需药物，最后再分离纯化。 （2）外泌体靶向改造 目前在技术上已经有了许多更新的先进疗法，例如RNA干扰、mRNA、AAV基因疗法和基因编辑平台，药物的设计不再是主要的限制因素，而是无法将它们递送到正确的细胞或位置。 外泌体可以利用其来自不同细胞来源的归巢效应来靶向特定器官。然而，来自常用临床级细胞系（如HEK293）的外泌体可能无法归巢于所需的靶器官。为了解决这个问题，可以通过将靶向部分工程化改造到囊泡上来，以改变外泌体的生物分布。通常会利用外泌体信号肽，将蛋白质导向到外泌体表面，以实现靶向性。 LAMP-2B即是一种常用于展示靶向基序的外泌体表面蛋白，它是溶酶体相关膜蛋白(LAMP)家族的成员，在细胞内主要定位于溶酶体和内涵体，在外泌体表面也有大量表达。通过将靶分子和LAMP-2B进行融合，可将靶分子展示到外泌体膜表面。 例如，表达与LAMP-2B融合的αγ整合素特异性iRGD肽(CRGDKGPDC)的外泌体能够将KRASsiRNA特异性递送至携带αvβ3的非小细胞肺癌的A549肿瘤，从而导致KRAS基因的敲低和肿瘤生长抑制。另一种LAMP-2B-RVG(RVG为一个神经特异性靶向肽），则可以通过同样的原理将外泌体导向到神经系统。除了LAMP-2B外，外泌体表面还有CD63、CD9、CD81、GPI、PDGFRs等结构提供丰富的想象空间。 （3）人工合成外泌体 由于细胞外囊泡的成分复杂，对于它们如何调节细胞之间信息传递的具体机制所知甚少，人们在改造外泌体的途径中另辟蹊径，希望创造一种人工合成的外泌体可以模仿自然外泌 09 体的特性，并使之具有更特异的靶向性，以实现外泌体领域的“弯道超车”。 在ScienceAdvances上发表的一项研究中，海德堡马克斯•普朗克医学研究所的研究人员带领的一支研究团队，根据对天然外泌体的详细分析，成功人工合成了外泌体，并且在试验中证实人工合成的外泌体能够调节和帮助伤口愈合以及有助于新血管形成。这是研究人员首次构建具有治疗功能的全人工合成外泌体，这一壮举无疑将进一步推动外泌体的发展。 在这项研究中，研究人员从脂质微滴起步，加入在天然外泌体中存在的微RNA（miRNA），以及在外泌体表面存在的蛋白，构建了模拟天然外泌体的人工合成细胞外囊泡。与分离的天然外泌体相比，这一从头合成的技术让研究人员能够对外泌体的功能进行微调，从而创立一种可“编程”的外泌体合成技术。 工程化外泌体表现出使其作为治疗药物载体的极具吸引力的关键特性，特别是它们