结直肠癌中共丰富菌群的变化及其在手术后的持续性：一项初步研究

科学报告|(2022) 12:9829| https://doi.org/10.1038/s41598-022-14203-z1 打开共同丰度的变化结直肠癌中的细菌组及其在手术后的持久性：一项初步研究钦文Png1,4, Yong-Kang Chua2,4, Jia-Hao Law2, Yongliang Zhang1 & Ker-Kan Tan2,3人们越来越关注肠道微生物组在结直肠癌 (CRC) 中的作用，从筛查到疾病复发。我们的研究旨在确定 CRC 的微生物标志物特征，并检查手术后细菌组的变化是否持续存在。收集了来自 25 名非癌症 (NC) 个体和 12 名 CRC 患者在手术前和手术后 6 个月的 49 份粪便样本，用于通过细菌 16S rRNA 基因测序进行分析。细菌丰富度和多样性降低，而易致癌细菌如脆弱拟杆菌和内脏臭杆菌则增加在 CRC 患者中与 NC 组相比。手术后不再观察到这些差异。术前和术后 CRC 的比较显示手术后益生菌丰度增加。同时，观察到与 CRC 进展相关的细菌在手术后有所增加，这意味着持续的生态失调。此外，基于功能通路的预测细菌 16S rRNA 基因数据显示，与 NC 相比，CRC 中的各种途径差异富集。 CRC 的微生物组特征包括改变的细菌组成。即使在手术后，这些菌群失调特征的元素仍然存在，这表明残余的未患病结肠可能发生场变化。未来的研究应该涉及更大的样本量，并在手术后的多个时间点收集微生物组数据，以检查这些生态失调模式是否真正持续存在以及是否与疾病结果相关。人体微生物组是人体的第二个基因组，其中微生物与宿主建立共生关系，以补充代谢缺陷、防止病原体入侵和维持免疫稳态1.越来越多的证据表明，肠道微生物群通过致病菌株的毒力因子影响结直肠癌的发展，最近的评论和论文表明某些微生物菌株与结直肠癌之间存在密切相关性2.已发现 CRC 患者体内富含细菌，如脆弱拟杆菌、具核梭杆菌和大肠杆菌7.发现与特定细菌种类富集相关的各种分子事件以及肿瘤微环境的变化可促进各种动物和离体模型中的 CRC 肿瘤发生9.这些与 CRC 相关的特定微生物菌株为开发 CRC 的诊断工具或治疗生物标志物提供了有希望的机会。然而，与幽门螺杆菌与胃癌之间建立的直接因果关系不同，细菌组与 CRC 之间的关系似乎很复杂，因为不太可能存在与 CRC 相关的单一病原菌12.已经报道了与 CRC 相关的不同微生物菌株，其中一些在其他研究中无法重现13.例如，Dejea 等人。通过高通量测序在 30 个 CRC 和 6 个人类腺瘤样本中发现没有与肿瘤相关的一致细菌属13.在另一项研究中，仅发现 20-30% 的 CRC 患者中与 CRC 相关性越来越高的广泛研究的梭杆菌属升高，这并不是一致的发现14.另一方面，其他研究发现了引发肿瘤的不同微生物，并提出了相关机制。例如，发现脆弱拟杆菌可促进 Th17 的发育，这限制了 IL2 在1新加坡国立大学杨潞龄医学院微生物学和免疫学系，新加坡，新加坡。 2新加坡国立大学医院外科结直肠外科。 3新加坡国立大学杨潞龄医学院外科，新加坡，新加坡。 4这些作者贡献相同：Chin-Wen Png 和 Yong-Kang Chua。电邮：surtkk@nus.edu.sg 科学报告|(2022) 12:9829 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14203-z2癌症（% 或 SD）n = 12健康（% 或 SD）n = 25年龄，平均值63.8 (± 9.3)61.6 (± 8.9)性别男性7 (58.3%)14 (56.0%)女性5 (41.7%)11 (44.0%)体重指数，平均值25.8 (± 4.0)25.2 (± 4.4)辅助化疗7 (58.3%)–表格1。参与者临床特征概述。主题年龄性别种族肿瘤位置TNM阶段手术M02-P57男性马来语乙状结肠3前切除术M03-P74女性中国人降序3左半结肠切除术M04-P56女性马来语乙状结肠1前切除术M06-P60女性马来语乙状结肠3前切除术M07-P67男性中国人乙状结肠2前切除术M08-P46男性中国人直肠3前切除术M09-P59女性印度人直肠2前切除术M11-P65男性中国人乙状结肠2前切除术M12-P65男性印度人直肠乙状结肠1前切除术M13-P69男性中国人乙状结肠3前切除术M15-P82女性中国人直肠乙状结肠3前切除术M16-P66男性中国人乙状结肠1前切除术表 2。癌症组患者的临床资料。局部微环境，而大肠杆菌释放大肠杆菌素是聚酮合酶岛的基因组产物，具有致癌性并促进结直肠癌的发展6.所有研究中的一个共同发现是 CRC 患者特有的肠道微生物组成的改变或失衡，这也被称为微生物失调。作为 Katarzyna 等人。强调，微生物“生态失调”是一个定义松散的术语，可以指微生物组成的变化、不平衡或特定微生物谱系的改变。它可以指分类或功能失调16.生态失调可能不足以在疾病中建立微生物群因果关系的任务，因为这种因果关系需要建立在坚实的科学基础上并满足“共生科赫假设”17.然而，现有文献表明，CRC 的发生和发展似乎是由多种微生物之间相互作用的集体微生物失调推动的，而不是由特定的病原微生物推动的。如果根治性手术后与 CRC 相关的微生物菌群失调状态持续存在，这也是不确定的。很少有研究调查治愈性 CRC 手术后的微生物变化。孔等人。报道了手术后拟杆菌门/厚壁菌门的比例降低，这可能导致肠道炎症19.包括肠球菌和梭杆菌在内的肿瘤相关微生物也被发现减少。然而，有益的专性厌氧菌如普氏菌在术后也减少了。据推测，如果微生物菌群失调与癌症有关，那么切除肿瘤不仅应去除病变，还应逆转伴随结直肠癌的菌群失调。另一方面，手术后持续的菌群失调可能表明“未患病”结肠可能发生区域变化，这首先使患者易患 CRC。因此，在本研究中，我们试图检查 CRC 患者手术前（手术前）和手术后（手术后）的共丰度细菌菌株的变化，并将它们与非癌症 (NC) 个体进行比较。使用 16S rRNA 基因测序，我们首先进行了经典的群落分析和统计检验，以比较 CRC 患者手术前后与 NC 个体之间的肠道微生物群落结构和组成。我们然后应用功能网络分析进一步检查它们之间的差异。结果研究人群。在这项研究中，我们共纳入了 37 名个体，其中 12 名是 CRC 患者，25 名是 NC 对照。使用 T 统计量（非中心性参数）功效计算，本研究中包含的样本数量提供了足够的功效来检测效果大小为 2，置信度为 95%，功效为 80%26.参与者和临床数据分别总结在表 1 和表 2 中。对来自 CRC 患者和 NC 对照的 49 份粪便样本进行细菌 16S rRNA 基因测序，以研究 CRC 患者术前和术后（术前和术后）微生物组的组成变化。总共获得了 2,559,498 个过滤序列，每个样本平均有 52,234 个序列（范围 3531-98,096）。绘制丰富度的稀疏曲线以分析样品的测序深度（补充图1）。 科学报告|(2022) 12:9829 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14203-z3甲乙1002507550250非癌症 (NC)术前术后Actinobacteriota Bacteroidota Cyanobacteria Desulfobacterota Firmicutes Fusobacteriota Proteobacteria Synergistota Verrucomicrobiota20015010050CF = 3.169R2=P = <0.001轴 1. 14.6% 非癌症 (NC) 术前 术后图1。NC 和 CRC 患者的粪便细菌组成不同。 (一个) 条形图显示了所有样本中存在的顶级细菌门。 (乙）CRC与NC对照组细菌α多样性的比较。 * 表示 p < 0.05（Wilcoxon 秩和检验）。 (C) 显示了源自样本间 Bray-Curtis 距离的细菌 β 多样性的主坐标分析 (PCoA)。 F统计，R2提供了比较的 & p 值（PERMANOVA）。与 NC 个体相比，CRC 患者的细菌多样性发生了变化。厚壁菌门、放线菌、疣微菌和拟杆菌是在所有样品中发现的最丰富的细菌门之一（图 1A），使用 Chao1、ACE 和 Simpson 评估了 3 个组的全球微生物 α 多样性。术后患者的 Chao1 和 ACE 指数显着降低（p < 0.05）。此外，与分析中的其他组相比，观察到术前患者的辛普森指数增加（p < 0.05）（Wilcoxon 秩和检验，图 1B）。使用 Bray-Curtis 相异距离的主坐标分析（PCoA），各组的 β 多样性分析表明 CRC 患者和 NC 之间存在明显的分离（图 1C）。此外，术后 CRC 患者的微生物组成呈现出更分散的分布，表明与术前 CRC 患者和 NC 相比，微生物组成不同。总之，数据表明与 NC 相比，CRC 患者的粪便细菌种类丰富度和多样性降低。与 NC 对照相比，CRC 患者术前和术后的分类学差异。图显示了患者和NC粪便标本中差异丰富的细菌的概述。基于细菌丰度的热图表示，很明显，属于放线菌、厚壁菌门、存在不同组的变形菌门、疣微菌门和拟杆菌门。值得注意的是，与手术前患者相比，一些属于放线菌门和厚壁菌门的特定增加，而一些拟杆菌门在术后患者中减少。进一步的详细分析揭示了与 NC 相比，术前和术后 CRC 患者中特定细菌 ASV 丰度的变化水平（图 3，补充数据 1）。如图 3A 所示，术前 CRC 患者具有较高丰度的几种拟杆菌 ASV。在术前 CRC 患者中发现拟杆菌、普通拟杆菌和脆弱拟杆菌增加。ɑ ≤ 0.0001，图 3A，术前列）。此外，其他细菌种类包括 ASV 769 内脏臭杆菌 ASV 694 Barnesiella intestinihominis、ASV 194 Anaerostipes hadrus、ASV 766 Blautia spp。与 NC 相比，术前 CRC 和 ASV 583 Eubacterium hallii 组增加超过 2 Log2 倍（图 3B）27.然而，这些差异不再被发现超1250高手辛普森*2000.9*150*0.9100500.7丰度百分比轴 2. 8.1% 科学报告|(2022) 12:9829 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14203-z4丰富409625616疣状微生物群变形杆菌 梭杆菌 厚壁菌门 脱硫杆菌 拟杆菌 放线菌图 2。热图显示了 NC 和 CRC 患者中差异丰富的细菌门。显示了与 NC 对照相比，CRC 中差异最大的细菌门（ɑ< 0.01，Wald 检验）。术后 CRC 与 NC 相比。值得注意的是，基于配对分析，与术前相比，术后 CRC 中拟杆菌属、B. caccae 和 B. vulgatus 的丰度降低（图 3B）。相比之下，术前患者的粪便样本减少了 ASV 308 Butyricimonas spp.、ASV 515 Eubacterium coprostanoligenes group、ASV 285 Catenibacterium spp。和 ASV 343 Lachnospiraceae FCS020 组，即使在术后这些细菌组仍然减少。此外，配对分析揭示了手术对 CRC 患者特定细菌 ASV 的影响。其中包括 ASV 269 肠杆菌属、ASV 193 克雷伯氏菌属的增加。和 ASV 21 Akkermansia muciniphila。与 CRC 发展相关的微生物功能特征。组间通路分析概述。使用 Picrust2 从细菌 16S rRNA 基因测序数据推断基因含量和功能途径。使用 ANOVA Tukey-Kramer 事后比较与 Benjamini-Hochberg 校正比较来自 NC、术前和术后组的最高差异丰富的 KEGG (KO) 配置文件33. P