卷尾猴 (Sapajus [Cebus] apella) 整个生命周期中胼胝体的髓鞘特征

科学报告|(2022) 12:8786| https://doi.org/10.1038/s41598-022-12893-z1 打开体的髓鞘特征卷尾猴 (Sapajus [Cebus] apella) 在整个生命周期中的胼胝体Chase M. Watson1、Chet C. Sherwood2 和 Kimberley A. Phillips1,3胼胝体 (CC) 的中矢状区经常被研究与大脑发育、连通性和功能有关。在这里，我们从电子显微镜中量化髓磷脂特征，以了解 CC 内发生的更完全不同的白质发育模式。我们将 CC 的中矢状区域细分为：I-喙和膝，II-喙体，III-前中体，IV-后中体，以及 V-峡部和压部。样本代表年龄从 2 周到 35 岁不等的卷尾猴（Sapajus [Cebus] apella，n = 8）。以系统随机方式获得髓鞘厚度、髓鞘分数和 g 比率的测量值。我们假设在早期发育过程中，CC 内会有一段快速的髓鞘生长时期。使用局部加权回归分析 (LOESS)，我们发现了区域差异在髓鞘特征方面，在早期发育中，后部区域的髓鞘厚度增加更快，g 比下降更明显。最前面的区域显示出髓鞘厚度的最持续增长。对于整个生命周期的所有区域，髓磷脂分数增加、稳定和减少。这些结果表明，在卷尾猴的 CC 发育早期和成年期，非线性髓鞘生长的差异模式发生了。胼胝体 (CC) 是胎盘哺乳动物大脑中两个大脑半球之间的主要连合白质束，建立同位和异位连接，并在感觉、运动和认知功能中发挥作用。胼胝体的中矢状区经常被研究与大脑发育和成熟有关1.在人类中，CC 在生命的第一年经历了巨大的增长，CC 的总面积和膝部、身体和脾脏的细分增加了 40-100%5.普约尔等人。3 据报道，CC 的大小持续增加，直到 20 年代中期，尽管在儿童期之后会出现较慢的增长。丹尼尔森等人。7，检查了 1000 多名年龄从 4 岁到 93 岁不等的参与者的 CC 发展，并在成年早期表现出明显的增长。这种增长主要是由包括压部在内的 CC 后部区域驱动的。这些生长模式存在明显的区域差异，与压部相比，膝部在前 6 年的增长率更高，而压部在 7 到 18 年的增长速度更快6.最近的一项研究报告了 CC 的快速发展，在大多数细分中显示出年龄和髓鞘水分数之间的二次关联8.非人类灵长类动物 (NHP) 是了解大脑寿命变化以及在关键时期对挑战的反应如何影响大脑发育并对表型产生持续影响的关键比较模型9. NHP 还显示在生命的最初几年中 CC 面积持续增加。在猕猴 (Macaca mulatta) 中，总 CC 大小从产前年龄增加到 32 周，其中压部的生长最多10.狒狒 (Papio hamadryas) 的 CC 持续生长至少到出生后第 32 周，其中压部的生长最大，膝部和前中体的成熟度最低11.已发现卷尾猴（Sapajus [Cebus] apella）中 CC 的多个区域从 4 天到 20 岁（成年中期）显示出正中矢状面积增加12.在黑猩猩（Pan troglodytes）和狒狒中，CC 的形态也在整个生命周期中进行了检查，包括后来的生命发育。在黑猩猩中，婴儿期迅速增加，随后在少年期和青春期中矢状CC面积逐渐增加13.韦斯特豪森等人。151美国德克萨斯州圣安东尼奥市三一大学心理学和神经科学项目系。 2部门美国华盛顿特区乔治华盛顿大学人类学和人类古生物学高级研究中心。 3西南国家灵长类动物研究中心，德克萨斯州生物医学研究所，美国德克萨斯州圣安东尼奥市。电子邮件： Kimberley.phillips@trinity.edu 科学报告|(2022) 12:8786 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12893-z2动物编号年龄（年）性别M10.04米M20.55米M30.55米F15.57FM46.71米M59.90米M616.66米F235.45F表格1。研究中使用的卷尾猴大脑的特征。还报告说，黑猩猩的 CC 中矢状面积在成年中后期没有显着下降。据报道，在成年后期，狒狒的中矢状面积也出现了类似的缓慢、持续生长和没有下降的模式16（阿努比斯狒狒）。胼胝体的微观结构和宏观结构之间的解剖和功能关系尚不完全清楚。 Aboitz 等人研究了 CC 的中矢状面积与纤维密度之间的关系，提出了胼胝体区域与丰富的小纤维微结构（在人类和恒河猴中）之间的关系。尽管已知髓鞘形成过程涉及，但人们对发育过程中发生的 CC 内的微观结构变化知之甚少。髓鞘形成在发育中起着重要作用，因为它可以保护轴突免受随后的损伤或损伤，并实现快速有效的神经传导17.米勒等人。20据报道，有髓轴突的密度在黑猩猩的许多皮质区域稳步增加，并在性成熟时达到成人般的完成，而在人类中，髓鞘形成在儿童期较慢，并持续到青春期后期。与年轻成年人相比，老年普通狨猴（Callithrix jacchus）显示出髓鞘厚度减少，CC 前部区域有髓轴突数量减少21.在这里，我们使用电子显微镜研究了从 2 周到 35 岁的簇绒卷尾猴 CC 内髓鞘结构的超微结构变化。簇绒卷尾猴（Sapajus [Cebus] apella）是来自南美洲的鸭嘴猴，以其复杂的操纵能力和觅食习惯而闻名，使其成为神经发育的有趣比较模型22.此外，先前的研究表明，卷尾猴在出生后表现出特别快的大脑生长和快速的运动技能发展。与除人类和类人猿以外的任何其他灵长类动物的大脑相比，新生儿卷尾猴大脑占成人大脑重量的比例较小（约 50%），这表明大部分体积增长发生在出生后生命的早期阶段24.我们在横截面样本群体中使用死后组织来探索轴突和髓磷脂的年龄相关变化。我们假设卷尾猴会在整个生命周期中表现出髓磷脂特征的动态变化，在 CC 的所有细分中，髓磷脂在早期发育过程中会迅速增加。方法标本。我们使用了八只卷尾猴（Sapajus [Cebus] apella）的福尔马林固定脑样本，年龄从 2 周到 35 岁不等（见表 1）。所有受试者都居住在社会上，仅参与西南国家灵长类动物研究中心（德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯生物医学研究所）或海勒姆学院（俄亥俄州海勒姆）的行为和认知研究。所有研究程序均由西南国家灵长类动物研究中心或海勒姆学院的机构动物护理和使用委员会批准。报告的所有方法均符合 ARRIVE 指南。所有动物均按照联邦认可的标准、指南和原则进行饲养。死亡原因包括急性呼吸系统疾病、在激进的社会交往后遭受的致命伤害，或因年老健康状况不佳而导致的安乐死。由于没有一个死因本质上是神经系统的，我们不认为髓磷脂的测量受到影响。死后 1 至 6 小时，取出大脑并浸入 10% 福尔马林中。在 7-10 天的初始固定期后，将大脑转移到含有 0.1% 叠氮化钠溶液的 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中，并在 4 °C 下储存，直到进行电子显微镜检查。电子显微镜。所有的大脑都在中矢状面一分为二，CC 从每个标本的左半球切开。然后，在先前研究的指导下，CC 被细分为五个区域，这些研究使用 DTI 纤维束成像来识别非人类灵长类动物中 CC 的功能划分25.结果分类遵循 Hofer 和 Frahm 的方案25;这些区域包括以下纤维投射：I = 前额叶（最前段覆盖 CC 的 1/6），II = 前运动和补充运动皮层（前半部分的剩余部分），III = 运动皮层（前半部分后半部减去后部 1/3），IV = 感觉皮层（后部 1/3d 减去后部 ¼），V = 顶叶、颞叶和枕叶（后部CC的1/4；见图 1a)。从每个区域的中心切下一块 1 mm × 2 mm × 1 mm 的小块，放入含有 1% 戊二醛和 4% 多聚甲醛的微量离心管中至少 1 周。使用改进的神经活检处理技术制备用于电子显微镜检查的样品9.样品在 1% Zetterqvist 的缓冲四氧化锇中后固定，脱水，用树脂浸润并在切片前包埋。 科学报告|(2022) 12:8786 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12893-z3图1。(一个) 卷尾猴 (Sapajus [Cebus] apella) 的胼胝体，表示五个区域细分 (I-V)。 （b) 0.55 年, (C)5.60 岁，（d) 9.90 岁，和 (e) 35.40 年。然后切割半薄切片并用甲苯胺蓝染色以在光学显微镜下检查以在继续之前验证方向。随后的超薄切片被安装在电子显微镜网格上，并在电子显微镜下观察之前用乙酸双氧铀染色。髓磷脂特征由从与 JOEL JEM 1230 电子显微镜耦合的数码相机拍摄的 5000 × 电子显微照片（受试者 X 的区域 I 和受试者 x 的区域 III 除外，它们是 10,000 ×）数字图像确定。每个受试者的每个 CC 细分平均测量 353 个轴突 (± 59)。轴突直径的计数和测量超过 26.3 × 26.3 μm2和 13.2 × 13.2 μm2 使用在 ImageJ 软件（ImageJ 版本 1.48）中实现的分馏器采样以系统随机方式的区域。每个感兴趣区域平均访问了 26 (± 3) 个采样点。轴突直径定义为长短比的拟合长轴和短轴长度的平均值，否则定义为短轴27. G比定义为内轴突直径与外髓轴突直径之间的比率28并估计轴突有多少是髓鞘，与其直径成正比。较小的 g 比表示较大比例的髓鞘。髓磷脂分数 (MF) 量化了采样框架中由髓磷脂组成的区域与非髓磷脂的比例。为了估计 MF，我们使用了一种自动图像阈值化和二值化方法，类似于其他人用来量化神经纤维分数的方法，并允许量化由髓磷脂组成的区域的比例29并在以前的工作中开发和使用21.测量由 CMW 进行，CMW 对受试者的年龄和性别视而不见；验证检查由 KAP 进行。统计分析。由于我们的样本量很小，我们无法进行统计分析来量化 CC 增长模式的区域差异。为了检查髓鞘厚度、髓鞘分数和 g 比的发育生长模式，我们使用了称为局部加权回归分析 (LOESS) 的非参数局部平滑模型31.与参数回归模型不同，该方法使用点的邻域（其大小由平滑参数 α 控制）对每个点 x 进行局部拟合，并由它们与点 x 的距离加权。因此，LOESS 不对数据结构做任何假设，非常适合对小样本量的增长曲线进行建模。这种方法通常用于模拟灵长类动物比较生物学研究中的生长32.使用这个模型，我们可以在不使用参数函数的情况下将曲线拟合应用于相对较少的数据点。使用拟合程序来避免偏差数据点导致平滑函数失真35.使用 alpha = 1 拟合数据。LOESS 拟合取决于使用的平滑参数。较小的平滑参数将导致过度拟合，并且拟合将对数据进行插值。如果平滑参数太大，拟合会过度平滑。理想情况下，选择的平滑参数将介于这两个极端之间。我们用来将平滑参数设置为 1 的策略是检查与预测变量相关的拟合残差图；然后，我们选择了在拟合残差中没有产生清晰可辨信息的最大平滑参数 (1)。对于所有 LOESS 分析，年龄最大的受试者（35 岁）被排除在外。由于下一个最大的受试者是 16 岁，我们认为 35 岁是一个异常值，因为年龄差距很大。来自 35 岁的数据在图中可视化。 RStudio 版本 1.2.5001 用于所有分析和数据可视化36. 科学报告|(2022) 12:8786 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-12893-z4图 2。胼胝体 I-V 区髓鞘厚度测量的核密度估计图。受试者按年龄表示。最年轻的受试者（0.04 岁）被排除在区域 IV 和 V 之外，因为在这些区域中没有发现有髓轴突。结果来自年轻和成年卷尾猴的代表性组织的电子显微照片如图 1b-e 所示。年轻的少年卷尾猴（图 1b）只有几个，有髓鞘的轴突。年轻的成年卷尾猴（图1c，d）具有较厚的髓鞘形成和较大密度的髓鞘轴突。在最古老的受试者的一些轴突中可以看到髓磷脂的降解，由层分裂表示（图 1e）。髓鞘厚度。在所有区域中，最常见的髓鞘厚度为 0.2 μm；很少观察到大于 0.4 μm 的髓鞘厚度。虽然不同年龄和地区的髓鞘厚度范围