动物病原微生物宏基因组高通量测序技术规范专家共识（2024版）

宏基因组高通量测序技术作为新兴的微生物检测工具，在动物病原微生物临床检测中发挥重要作用，但行业缺乏一致性、规范性认识。本文从实验室建设及管理、实验操作、生物信息学分析、结果判定、质量控制、报告审核等方面阐述了专家共识，并提出规范性要求和建议。

1. 实验室建设基本要求

   • 生物安全要求：实验室需具备生物安全二级（BSL-2）及以上条件和资质，严格按照农业农村部要求操作。
   • 实验室结构布局：分为湿实验（样品前处理、核酸提取、文库制备、测序）和干实验（生物信息学分析），需严格控制气溶胶污染，功能区域包括体系配制室、样品处理室、核酸提取室、文库制备室、测序室。
   • 人员配置：实验人员需具备分子生物学和微生物学技能，数据信息分析人员需具备生物信息学技能，结果和报告审核人员需具备动物医学专业背景和兽医临床经验，均需通过岗位培训和考核。
   • 测序平台：可选择二代测序（NGS，数据量大、成本低）或三代测序（TGS，读长长、实时产出），根据样品数量、测序长度、准确度、数据量、时效性和成本等因素选择。

2. 实验操作

   • 样品采集及制备：优先选择感染部位体液或新鲜组织，执行无菌操作，使用无菌采样工具，标记清晰样品信息，低温运输，及时送检或按规定保存。不同样品类型需采用不同前处理方式。
   • 核酸提取：可选用自动化或手动提取，根据测序目的选择DNA、RNA或共提取，建议使用经验证的宏基因组测序试剂。
   • 文库制备：根据测序目的选择DNA、RNA或共建库，需评估核酸投入量、片段大小、浓度和纯度等指标。
   • 上机测序：按照仪器说明书操作，确认碱基识别质量、N50、有效数据量等符合要求。

3. 生物信息学分析

   • 数据库：中国尚无专用数据库，通常使用NCBI等公共数据库，但存在假阳性和假阴性问题。建议自建或使用商品化动物病原微生物数据库，并定期更新。需建立专用的动物宿主数据库，配备高性能服务器。
   • 数据分析：包括数据预处理（去除接头、低质量序列）、去宿主（常用BWA、Bowtie2等）、物种鉴定（至少到种属，常用Kraken2、BLAST等）、致病微生物识别（结合临床症状和致病病原微生物数据库）。

4. 结果判定

   • 建议将微生物序列数进行归一化（RPM或RPTM），以归一化后的序列数、物种覆盖度或相对丰度为基础，结合阴性对照、样品信息和临床症状制定判定标准，建议阈值为检出3条序列且覆盖3个非重复区域。

5. 质量控制

   • 数据质量控制：文库质量需评估插入片段大小、浓度等；测序数据建议二代测序Q30≥90%、序列数≥10M，三代测序Q10≥80%、数据量≥1Gb。
   • 阴性对照：每批实验加入，监控实验过程，建议使用无支原体和外源病毒污染的洁净细胞或异源核酸。
   • 阳性质控品：平台或方法改变时需验证，建议包含DNA病毒、RNA病毒、革兰氏菌、真菌、寄生虫等6类病原。

6. 测序报告

   • 报告内容：包含物种信息、样品类型、临床症状、微生物名称、序列数、覆盖度、相对丰度、质控数据等，对重要病原需注释临床症状、易感动物、传播途径等。
   • 报告解读：结合临床症状和流行病学信息解读结果。

7. 小结
   宏基因组高通量测序技术优势显著，但流程复杂，对技术平台和人员要求高。本共识旨在通过完善流程和应用策略，指导行业更好发展。