靶向蛋白质降解剂的新兴药物发现策略白皮书

靶向蛋白降解（TPD）的新兴药物发现策略 新分子类型药物正在改变由小分子为主导的药物发现格局，其中多肽、寡核苷酸以及细胞和基因治疗等为诸多尚未被满足的治疗需求提供了新的选择。 另一种新兴的模式是将传统的小分子亚基组装成一个更大的分子，以触发靶向蛋白降解。蛋白降解靶向嵌合体（ProteolysisTargetingChimera,简称PROTAC）就是此类策略的代表，它能特异性结合靶蛋白（ProteinofInterest,POI），并通过结合E3连接酶配体，使靶蛋白和E3连接酶被招募到一起，利用体内泛素-蛋白酶体途径特异性地降解靶蛋白[1-3]。 靶向蛋白质降解技术能够有效地降解那些传统小分子疗法难以靶向的致病蛋白，为难以成药的靶点提供了新的成药方法。研究人员已经利用PROTAC来靶向位于细胞质、细胞核和膜的目标蛋白[4]。两款PROTAC疗法在2019年进入了临床I期，截至目前，至少有20个项目处于临床阶段，涵盖癌症、免疫性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病和病毒感染等多种适应症[5]。 PROTAC的研发遵循与小分子药物类似步骤：靶点验证、化合物优化、体外机制研究以及体内药效、药代和毒理测试。然而，PROTAC复杂的作用机制增加了药物研发的难度。选择适当的筛选和分析技术来表征和优化PROTAC的功能，有助于简化PROTAC的开发流程。 药明康德药物发现服务总监KrisRutten在一场网络研讨会中表示：“在过去20年的研究中，合成的双功能小分子开始在药物研究领域证明其价值。这些分子的开发，不仅能增进我们对多种生物通路功能的理解，同时也将推动下一代治疗策略的开发”[2]。 双功能分子的作用机制 在PROTAC治疗策略中，POI配体与E3连接酶配体连接，E3连接酶配体可以特异性结合E3泛素连接酶。PROTAC与POI和E3连接酶结合，使它们紧密接触。随后，E3连接酶会在POI的多个赖氨酸残基上连接多个泛素亚基，通过泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasomesystem,UPS)识别并降解这些已经被泛素化的靶蛋白（图1）。UPS是细胞进行降解和回收损坏蛋白质的主要胞内机制，PROTAC能够“劫持”UPS，诱导能与其配体结合的蛋白质降解[6]。 与传统小分子通过干扰蛋白质活性位点（如酶或受体）发挥作用不同，PROTAC可以将可成药的靶点扩展到任何可结合小分子配体的蛋白质，且不需要长时间高浓度地结合，这为其作为潜在药物提供了更多可能性。虽然科学家估计，人类蛋白质组中仅10%-15%的蛋白质被认为是可成药的，但更多的蛋白质被认为具有配体性（ligandability），这些蛋白质有潜力通过PROTAC转化策略进行药物开发[7,8]。 当靶蛋白被标记并降解后，PROTAC分子会被释放�来，进行下一轮的结合和降解。这种催化式、可循环的作用方式使PROTAC能够以更低的剂量获得更高的活性，即使是低亲和力的配体也能诱导靶蛋白的高效降解[9]。 图1.PROTAC结构(A)及PROTAC诱导靶向蛋白降解的机制(B) 挑战 PROTAC的研发并非易事，由于需要在单一分子上连接两种不同蛋白质的适合配体，这使得所有常见药物研发过程中的挑战在PROTAC的开发过程中可能会被放大。 PROTAC的开发需要验证和监测双功能分子与其POI和E3泛素连接酶的结合情况。三元复合物的形成可能会引发一些与结合动力学和热力学相关的非常规现象。例如，即使二元相互作用紧密，也不能保证形成稳定的三元复合物，这背后的机制仍需要进一步研究。此外，“钩子效应”(hookeffect)也可能�现，即在PROTAC分子浓度较高时，可能优先分别与E3连接酶或靶蛋白形成无效的二元复合物而非三元复合物，这可能会削弱药效，所以可能需要使每个二元相互作用的强度相似[10]。此外，两种配体和连接区可能产生各种不同的潜在脱靶效应。 一般来说，PROTAC的分子量在750Da左右，比常规小分子略大。这可能限制其透膜性、溶解度和生物利用度，因此在PROTAC开发中需要考虑这些因素，需要采用特殊的剂型。 值得一提的是，Arvinas公司开发的两种口服PROTAC蛋白降解疗法当前已经进入临床II期阶段，并已证实能诱导与乳腺癌和前列腺癌相关的激素受体降解，这进一步验证了PROTAC口服制剂的潜力[11]。 利用DEL技术进行常规配体的合成和筛选 DNA编码化合物库（DNAencodedlibrary,DEL）技术非常适用于POI配体发现，尤其是当这些配体用于PROTAC的开发时。DEL分子因为天生带有一段连接子，为构建二价PROTAC分子提供了理想的起点。在本节中，我们将探讨如何使用DEL技术来发现与POI结合的常规配体。在下一节中，我们将探讨连接子的选择如何影响PROTAC的生物利用度和其他药物属性。 DEL中的分子是通过"均分-混合"（"Split&Pool"）的组合化学方法来构建的。首先，不同的分子砌块会与一个包含起始标签、间隔片段和头部片段的双功能连接子结合，然后，每个带有双功能连接子的分子砌块会被连接到一段特定的DNA序列上，这个DNA序列编码了分子砌块的身份信息。接着，将各种分子砌块混合在一起（pool）并均分（split）到下一轮不同的反应容器中。在每个反应容器中，再添加一个新的分子砌块和编码该分子切块的DNA序列进行反应。 以上过程可以根据设计的合成路线和循环次数，重复进行两到四轮。通过这种"Split&Pool"的方法，化合物库的多样性可以实现指数级增长。比如，如果100个化合物分子砌块经过 三轮100种不同分子砌块的修饰反应，通过这种组合化学策略可以得到包含1亿个分子的库（100*100*100）。来自不同合成反应路线的库可以进一步混合在一起，组合形成一个超级库（superpool），进一步提高库多样性。 DEL库中的分子混合物可以通过亲和筛选的方法进行筛选，发现与目标蛋白有潜在结合力的苗头化合物分子。用以确定它们是否与目标蛋白质结合。这种筛选方法只需要简单基础的实验开发和实验室设备。通过DNA序列扩增和二代测序技术，我们可以快速识别这些潜在的阳性分子。图2展示了药明康德利用专有的DNA编码化合物库来发现苗头化合物的蛋白种类。 图2.利用药明康德DEL技术筛选配体的蛋白质类别 连接子(Linker)优化 理论上，合成双功能分子就是简单地连接靶蛋白配体和E3连接酶配体，但实际上，连接这两个配体的连接子结构需要进行仔细的设计和选择。 连接子可以改善PROTAC分子的理化性质。连接子的长度、亲脂性和刚性都可能对POI和 E3连接酶的结合、细胞膜渗透性、代谢稳定性以及其他类药的理化参数产生重大影响。 连接子既可以是线性的柔性结构，如常见的聚乙二醇和烷基链。另一种选择是融环或螺环系统，它们能构建更刚性的结构。刚性连接子可以将分子限制在具有生物活性的构象中，且杂环结构能提高溶解度，因此这类连接子越来越受到关注。过短的连接子可能会阻碍有效的三元复合物的形成。由于形成三元复合物的过程在热力学上十分复杂，连接子的精确长度和刚性可能以难以预测的方式影响PROTAC的药效[10】。因此，建立多样化的连接子库，并配备相应的筛选工具，将有助于优化连接子设计并缩短开发周期。 通过SolutionDEL技术直接发现PROTAC分子 模块化的合成方式使得DEL库可以在合成中包含不同E3配体、连接子和POI配体组合，从而形成多样化的双亲和力PROTAC分子库。这三种模块中的任意一种都可以作为DNA的连接位点。常见的库构建策略是，固定已知的E3连接酶配体或靶蛋白配体，而连接子和另一端的化合物则由多样的分子砌块组成，用于筛选靶蛋白或E3连接酶的受体。 药明康德已经积累了一个含有超过90亿双功能分子的DEL库（图3），这些双功能分子含有不同的DNA连接位点。现货DEL双亲和力PROTAC库采用固定的CRBN或VHL配体。于 此同时，还保留了一些中间体库，这些库包含各种组合化合物和连接子，以及用于配体连接的连接位点。这些中间体库可以帮助快速构建以已知E3或POI靶点为中心的双功能PROTAC文库。 图3.利用DEL技术合成的双功能PROTAC示意图 筛选双功能分子DEL的方法与筛选传统单靶向配体的方法有所不同。双功能DEL筛选的目的是寻找那些能够诱导E3连接酶和目的蛋白结合形成三元复合物的分子。药明康德正在尝试几种筛选双功能分子的DEL方法，以期能够直接从DEL库中筛选得到潜在的PROTAC分子。尽管这几种方法在细节上有所不同，但是他们核心原理都是寻找更有助于三元复合物形 成的分子（图4）。 图4.用DEL筛选双功能分子（如PROTAC）方法示意图。以PROTAC为例，靶点1代表POI，靶点2代表E3连接酶。通常情况下，两种条件会同时筛选和比较；1.同时存在目标蛋白和E3连接酶；2.仅存在目标蛋白或E3蛋白。 通过BEADDEL技术发现PROTAC分子 除了SolutionDEL筛选策略，药明康德还构建了OBOC（onebeadonecompound,OBOC）DEL文库筛选平台（OBOCDEL）。在OBOCDEL中，每一个小分子及其对应的DNA序列都会被固定在一个微珠上。无论是常规的OBOCDEL还是专门设计的双功能OBOCDEL，都可以用于筛选。双功能OBOCDEL的优势在于它能够直接检测三元复合物的形成。 在双功能OBOCDEL的筛选过程中，整个化合物库会与E3连接酶和POI同时孵育。然后，针对E3连接酶和POI的特异性抗体将被引入，用于检测这两种蛋白质的存在。如果微珠上的小分子能够同时招募POI和E3连接酶，相应的特异性抗体就能够识别这些小分子和微珠。基于荧光信号，流式细胞仪可以检测并筛选�能诱导三元复合物形成的活性化合物。 与SolutionDEL相比，OBOCDEL提供了更直接的双特异性检测方法。此外，通过使用可光切的连接子将双功能分子与微珠连接，活性化合物可以轻易地从微珠上释放，用于进一步生化或细胞筛选（图5）。 图5.OBOCDEL的双功能分子示意图。通过使用可光切的连接子连接双功能分子和微珠，化合物可以轻松地从微珠上释放，用于生化或细胞筛选。 生物表征 合成�PROTAC分子后，下一步的开发工作包括定量分析结合事件。结合测试包括先进的生化、生物物理和细胞方法，以研究PROTAC-POI-E3连接酶三元复合物的形成、稳定性和动力学特性[12]。然后，采用其他方法来确定是否因三元复合物的形成导致有效的蛋白质降解。 研究二元复合物（PROTAC-E3连接酶和PROTAC-POI）形成的常见检测方法包括时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)、荧光偏振(FP)、表面等离子体共振(SPR)、微量热泳动(MST)和新型生物发光共振能量转移法（NanoBRET）。 除了上述技术以外，还可以利用NanoLuc®二元技术（NanoBiT）等细胞内检测方法监测三元复合物的形成。NanoBiT检测法将肽亚基与涉及PROTAC功能的每种蛋白质（POI和E3连接酶）融合在一起。当两种被标记的蛋白质相互作用时，肽亚基结合并产生荧光信号。AlphaScreen是另一种常用的测定蛋白质复合物形成的方法，其信号产生基于邻近微珠之间的能量转移。 在测定�三元复合物形成后，下一步是确定PROTAC功能是否具有特异性的蛋白质降解功能。通常而言，可以采用Westernblot、in–cellWestern(ICW)、AlphaLISA、TR-FRET和HiBiT等方法检测。与Westernblot相比，ICW和HiBiT可以进行蛋白质降解的定量测量，从而确认预期的蛋白降解是否是通过UPS进行的，而RT-PCR可以确认蛋白质的减少不是由转录 抑制造成的。 研究人员拥有一套丰富的分析技术，可用于研究蛋白质-PROTAC相互作用、三元复合物的形成、泛素化和降解的动力学，同时需要根据药物发现阶段的具体