TGF-β1/Smads/α-SMA通路的激活与神经源性膀胱患儿的组织学和功能变化有关

科学报告|(2022) 12:9285| https://doi.org/10.1038/s41598-022-13470-01 打开激活 TGF-β1/ Smads/α-SMA通路与组织学相关和儿童的功能变化神经源性膀胱杨兴焕1,2,3, 青松浦1,2,3, 文一博1,2,3, 易赵1,2,3, 王俊奎1,2,3, 徐鹏超1,2,3, 元马1,2,3, 二鹏刘1,2,3, 雷律1,2,3 & 建国文1,2,3本研究旨在探讨 TGF-β1/Smads/α-SMA 通路的表达及其对神经源性膀胱 (NB) 儿童膀胱组织学和功能的影响。将 10 名 NB 患儿和 8 名膀胱输尿管连接部梗阻患儿的膀胱标本收集到 NB 组和对照组。检测膀胱组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad6、α-SMA、纤连蛋白、I型胶原和III型胶原的表达。此外，组织学评估膀胱的特性。对所有患有 NB 的儿童进行了术前尿动力学研究。我们分析了标记蛋白a-SMA表达之间的相关性在肌成纤维细胞、通路的效应细胞和膀胱功能参数中。与对照组比较，NB组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、α-SMA、纤连蛋白、I型胶原和III型胶原的表达明显升高，而Smad6的表达降低（p < 0.01)。 NB组的HE和Masson染色显示胶原蛋白水平升高和平滑肌细胞肥大。 NB 患儿膀胱容量比 (BVR) 低，顺应性低 (△C) 最大膀胱压力高、最大流量低、排尿后残留量大、膀胱收缩指数低和膀胱排尿效率低。表达方式α-SMA 与 BVR 呈负相关 (r = − 0.7066, P = 0.0223) 和△C (r = - 0.6516,P = 0.0412）。我们得出结论，TGF-β1/Smads/α-SMA 通路在膀胱组织中被激活。患有 NB 的儿童，可能参与导致组织学和功能变化的过程。众所周知，神经源性膀胱 (NB) 是由控制下尿路的神经系统异常引起的，其中儿童最常见的原因是脊柱发育不良。这会导致膀胱和尿道功能障碍，包括膀胱过度活动症、逼尿肌括约肌协同失调和膀胱活动不足或逼尿肌收缩1.这些异常会导致膀胱通过代偿机制将尿液排出体外，例如容量增加或收缩力增加2.随着疾病的进展，膀胱重塑和膀胱功能进一步恶化，导致膀胱容量下降，顺应性差和残余尿增加3.这些变化破坏了膀胱输尿管连接处的抗反流机制，导致尿液反流，从而导致上尿路扩张、肾组织损伤甚至肾功能衰竭，从而增加死亡风险4.膀胱失代偿的过程主要被认为与膀胱重塑，尤其是膀胱纤维化恶化有关6.因此，预防膀胱组织学变化可能有效延缓疾病进展，但这一过程背后的具体分子机制仍不清楚。TGF-β1已被证明是参与各种器官组织学变化的重要因素8.在这些组织的纤维化进展过程中，TGF-β1与其受体结合并通过与下游Smad蛋白相互作用参与细胞内信号转导，调节相应基因的表达，1郑州大学第一附属医院小儿泌尿动力中心,河南国际小儿泌尿动力联合实验室,郑州 450052 2河南省国际儿科泌尿动力联合实验室，中国郑州。 3膀胱结构与功能重建实验室（河南省发改委），郑州。邮箱：wenjg@hotmail.com 科学报告|(2022) 12:9285 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13470-02并增加肌成纤维细胞数量。肌成纤维细胞产生过多的细胞外基质（ECM），包括胶原蛋白和纤连蛋白（FN），从而导致纤维化9.我们建立的脊髓横断大鼠模型和其他与膀胱出口梗阻相关的大鼠实验结果发现，TGF-β1/Smad通路成员在膀胱组织中高表达，可能介导结构和功能的变化11.这条通路是否也与 NB 儿童膀胱的变化有关尚不清楚。在本研究中，我们比较了 NB 患儿膀胱标本的病理特征和通路相关蛋白的表达，并分析了肌成纤维细胞标志物（α-SMA）的表达与膀胱功能参数之间的相关性，以探讨对 NB 的影响。该通路对膀胱组织学和功能的影响。本研究结果可为理解NB变化的机制提供重要参考。结果通路的表达。NB组和对照组膀胱组织中通路表达存在显着差异。 TGF-β1和α-SMA的Western印迹分析显示，NB组膀胱组织中TGF-β1和α-SMA的表达明显高于对照组膀胱组织中的表达（图1a）。免疫组化染色显示，与对照组相比，NB组Smad2、Smad3和Smad4的表达增加，而Smad6的表达减少（图1b）。组织学改变。HE和Masson染色显示NB组膀胱组织有明显的组织学改变。 HE染色显示NB组逼尿肌细胞变性，形态异常，细胞肥大，细胞质比增加，核质比降低（图2a）。 Masson染色显示NB组逼尿肌细胞间存在大量无序且多样化的胶原纤维，导致细胞间距明显增加。此外，NB组的胶原体积分数（CVF）值显着高于对照组（图2b）。纤维化相关蛋白的表达。纤维化相关蛋白的特异性染色显示 NB 组的表达高于对照组。天狼星红染色显示NB组膀胱组织中Col I和Col III的表达增加，Col III与Col I的面积比较对照组增加（图3a）。免疫组织化学染色显示，NB 组中 FN 的平均光密度（AOD）值高于对照组（图 3b）。α-SMA表达与膀胱功能参数的相关性。总结 10 例 NB 患儿膀胱功能参数后，发现最大膀胱容量（MCC）、膀胱容积比（BVR）、顺应性（△C)、最大流速 (Qmax)、膀胱收缩指数 (BCI) 和膀胱排尿效率 (BVE) 值均低于正常范围，而充盈期间的最大逼尿肌压力 (maxPdet) 和排尿后残余压力 ( PVR) 值显着更高（表 1）13. α-SMA 表达与膀胱功能参数的相关性分析表明，α-SMA 表达与 BVR 呈负相关（r = - 0.7066，p < 0.05），△C (r = - 0.6516, p < 0.05)（表 1，图 4）。讨论NB的治疗已广泛采用药物、手术等多种治疗方法，但疗效仍不理想18.这可能是因为大多数治疗只针对症状，不能有效预防膀胱组织学或功能的变化。这一过程背后的机制仍不清楚，因此很难找到更有效的治疗方法。我们的研究表明，NB 患者的 TGF-β1/Smads/α-SMA 通路被激活，这可能与膀胱组织学和功能的变化有关。TGF-β1是一种重要的细胞因子，与许多生理过程有关，包括分化、增殖、免疫调节和组织修复。8.它与细胞表面的异四聚体受体结合以激活和磷酸化 Smads，这是该途径中的关键下游调节剂。此后，信号被传递到细胞核以激活相应靶基因的表达19.在组织纤维化过程中，磷酸化的 Smad2 和 Smad3 与共同的调节因子 Smad4 形成异质复合物促进纤维化发展，而 Smad6 在此过程中起主要的负调控作用20.肌成纤维细胞是该途径的主要效应细胞。研究表明，肌成纤维细胞数量的增加会导致 ECM 过度积累和组织纤维化21. α-SMA 蛋白（肌成纤维细胞标志物）的表达在诱导组织纤维化时增加23.很少有研究调查该途径调节 NB 儿童膀胱变化的机制。有研究报道该通路可能在 NB 和部分膀胱出口梗阻 (PBOO) 大鼠模型的膀胱纤维化过程中发挥作用，丹参酮 IIA 磺酸钠 (STS) 的使用被证明可有效抑制膀胱的发生。 PBOO 大鼠中由该途径介导的纤维化11.我们的研究首先发现 NB 患儿膀胱中 TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 和 α-SMA 的表达增加，而 Smad6 的表达显着降低（图 1）。该结果表明该途径被激活并且NB患者的肌成纤维细胞增加。由于这一过程可能介导纤维化的发生，因此推测NB中纤维化的机制与其他组织中的类似，是由该通路介导的。这一发现将为该领域未来的研究提供重要依据。Howard PS用TGF-β1及其拮抗剂体外培养人膀胱平滑肌细胞（SMCs），发现TGF-β1不仅增加I型和III型胶原蛋白的表达，而且引起逼尿肌 科学报告|(2022) 12:9285 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13470-03图1。NB和对照组中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad6和α-SMA的表达：（一个) TGF-β1 和 α-SMA 的蛋白质印迹分析。比较两组TGF-β1和α-SMA与β-actin的灰度值比值。从相同的印迹中裁剪出代表性的蛋白质印迹。原始印迹出现在补充材料中。 (b) Smad2、Smad3、Smad4 和 Smad6 的免疫组织化学染色。图中棕黄色区域表示靶蛋白染色阳性。比较两组各Smad蛋白的AOD值。条形表示 20 μm。数据显示为平均值±SD。 **p < 0.01; ***p < 0.001； ****p < 0.0001 与对照相比。学生 t 检验。 AOD，平均光密度。肌肉细胞肥大。因此，他得出结论，TGF-β1 不仅介导纤维化，而且介导逼尿肌肥大。26.在本研究中，我们通过 HE 和 Masson 染色发现了类似的病理变化。患有 NB 的受试者不仅表现出纤维化，而且表现出逼尿肌肥大（图 2）。这些发现表明 NB 儿童的膀胱重塑包括纤维化和逼尿肌肥大，并且 TGF-β1 介导的通路的激活可能在这一过程中发挥重要作用。然而，TGF-β1介导的逼尿肌肥大的后续细胞内信号传递过程和特征尚不清楚，将是我们未来研究的一个方向。组织纤维化的发生与胶原蛋白和纤连蛋白的沉积有关，两者都是评价纤维化程度的关键指标。研究发现，Col I 和 Col III 是参与膀胱纤维化的主要胶原蛋白，其特征是 III 型胶原蛋白与 I 型胶原蛋白的比例增加27.天狼星红染色结果的相对定量分析显示，膀胱组织中 Col III 和 Col I 的表达以及比例增加（图 3a）。这一结果进一步探索并证实了NB中胶原蛋白的变化特征。这一结果可以很好地提醒人们寻求新的诊断和干预措施。 FN 被发现在该组织中发挥着联系作用。胶原蛋白沉积在细胞之间 科学报告|(2022) 12:9285 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13470-04图 2。NB组和对照组膀胱组织HE和Masson染色：（一个) 膀胱组织的 HE 染色。图中红色区域代表逼尿肌细胞质，紫蓝色区域代表细胞核。黑色箭头表示逼尿肌细胞。两组的 CSA 值分别为比较的。条形表示 20 μm。 (b) 膀胱组织的马松染色。图中蓝色区域代表胶原纤维，红色区域代表肌肉纤维。白色箭头表示胶原纤维。比较两组的CVF值。条形表示 20 μm。数据显示为平均值±SD。****p < 0.0001 与对照相比。学生 t 检验。 CSA，平均横截面积。 CVF，胶原蛋白体积分数。通过绑定到 FN28.在此，NB组膀胱组织中FN的表达增加（图3b）。这些变化表明NB的纤维化过程与这两种成分的表达增加有关。通过治疗控制这些蛋白质的产生可以有效地防止膀胱纤维化的发展。NB患儿在疾病早期可能出现膀胱功能异常，包括逼尿肌过度活动、逼尿肌括约肌协调障碍、膀胱活动不足或逼尿肌收缩不良，随着疾病进展膀胱功能恶化3.我们对 10 名 NB 患儿进行了术前尿动力学研究（UDS），发现膀胱功能参数明显异常。结果显示在充盈期膀胱顺应性低、膀胱容量低和膀胱内压高。在排尿期观察到膀胱收缩功能弱、尿流率低和残余尿量大。这些变化将阻止尿液从体内的有效排出，并增加上尿路损伤的风险13.这表明应该在足够长的时间内防止膀胱功能的变化，以减少上尿路损伤。然而，膀胱功能改变的具体机制仍不清楚。目前认为与神经支配异常、ECM 积累增加和 SMC 功能异常有关2.我们的研究发现，α-SMA 蛋白的相对蛋白水平与 BVR 和△C，表明肌成纤维细胞数量的增加可能影响膀胱功能，可能是由于细胞外基质（ECM）的过度表达。研究表明，大量的 ECM 沉积会增加组织的硬度，从而降低顺应性。这些变化降低了膀胱的扩张性，从而降低了膀胱容量。同时，ECM 积累的增加导致组织中逼尿肌的百分比降低，细胞之间的空间增加。这些变化可能会影响信号传输和细胞间接触的数量，从而导致收缩功能降低