新型脊髓骶神经损伤大鼠模型的功能、形态和分子特征-手术方法、病理过程和临床相关性

科学报告|(2022) 12:10026| https://doi.org/10.1038/s41598-022-13254-61 打开功能，形态和分子特征在脊髓骶神经损伤的新型大鼠模型中 - 手术方法，病理过程和临床相关性李俊阳1,2, 李世强3, 王宇4,5 & 艾嘉尚1,2,5脊髓骶神经损伤是与骶骨骨折、脊髓栓系综合征和骶管肿瘤等多种疾病相关的最严重疾病之一。脊髓骶神经损伤可导致膀胱去神经和逼尿肌功能低下。解决脊髓骶神经损伤相关逼尿肌功能低下患者的临床经验有限，因此治疗选择也很少。在本研究中，我们建立了脊髓骶神经损伤动物模型，以加深对该疾病的认识和进一步研究。包括 40 只 8 周（周）大的 Sprague Dawley 大鼠，平均分为假手术组（n = 20）和粉碎组（n = 20）。挤压组大鼠双侧骶脊神经被挤压，假手术组不挤压神经。在三个时间点（1 w、4 w和6 w）进行综合评价，以了解该病的性质过程。根据尿动力学检查、超声检查和逆行尿路造影，与假手术组相比，我们可以在观察期内显示脊髓骶神经损伤后膀胱功能障碍严重。组织学检查（苏木精-伊红和马森三色染色）进一步反映了这些功能变化神经和膀胱的微观结构。神经/膀胱的免疫染色显示雪旺氏细胞死亡、轴突变性和膀胱胶原重塑。聚合酶链反应结果显示损伤后 1 周出现剧烈的神经炎症和膀胱纤维化，炎症/纤维化在 4 周恢复正常。进行了 CatWalk 步态分析，两组之间没有明显差异。总之，我们建立了一个可靠且可重复的脊髓骶神经损伤模型，该模型为评估治疗策略和了解脊髓骶神经损伤的病理过程提供了一种方法。它使我们能够了解脊髓骶神经损伤后神经退行性变和膀胱纤维化如何发生变化，以及治疗选择如何促进恢复，以供进一步研究。缩写SSNI脊髓骶神经损伤LPP泄漏点压力MBV最大膀胱容量个人录像机后空隙残留杜逼尿肌活动不足LUTD低尿路功能障碍1南开大学医学院,天津 300071 2中国人民解放军总医院神经外科，北京复兴路28号 100853 3中国人民解放军第80集团军医院,山东 261021 4中国人民解放军总医院第四骨科研究所，北京，中国。 5南通大学神经再生协同创新中心, 南通 226007邮箱：shangaj@126.com 科学报告|(2022) 12:10026 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13254-62集成电路国际尿失禁协会电脑断层扫描计算机断层扫描美国超声PE 聚乙烯RAS运行平均速度功放打印区PL打印长度TS脚趾传播它的中间脚趾传播氨基苯甲酸爪角体轴 H&E 苏木精-伊红结核病甲苯胺蓝TCS脊髓栓系综合征周围神经损伤在世界范围内发生，并且仍然是医生的一个问题。以往关于周围神经损伤的许多研究都集中在臂丛神经和坐骨神经上，其功能表征和潜在分子机制已得到明确证明1.然而，与其他周围神经相比，脊髓骶神经的损伤有时会被忽视5.脊髓骶神经损伤的病因并不罕见，但常见且广泛，例如脊柱裂6, 脊髓栓系综合征7, 骶前脑膜膨出8, 骶管囊肿和骶骨骨折10.与其他通常导致运动功能障碍的神经损伤相比，脊髓骶神经是一种混合神经，包括运动神经、感觉神经和自主神经（副交感神经）。13 主要支配膀胱和肠道5.因此，脊髓骶神经中的自主神经纤维受损会导致逼尿肌功能低下，引起神经源性膀胱。16.有临床研究表明，35%的骶骨横断骨折患者有骶神经根横断损伤，骶神经损伤相关的尿路症状可长期持续11.对于骶骨骨折多发伤患者，很多医生只关注外伤、血肿和出血，而忽视了骶神经检查。错过了脊髓骶神经抑制的早期时间窗的患者在晚期会出现严重的下尿路症状10.脊髓栓系综合征可导致沿骶神经的张力增加和骶神经内的神经内压。这些患者的尿动力学检查提示逼尿肌功能低下、排尿后残留物升高或膀胱输尿管反流。超过一半的脊柱裂或脊髓栓系综合征患者表现出严重的尿路症状6.早期及时释放可以提高生活质量，防止泌尿系统损害的进展7.此外，骶管囊肿、腰骶部肿瘤和医源性因素（盆腔手术）都可引起急性或慢性脊髓骶神经损伤8.因此，脊髓骶神经损伤并不少见。多学科合作的实施是必要的，疾病的潜在病理生理机制和潜在的治疗策略需要进一步探索。逼尿肌活动不足虽然在临床实践中并不罕见，但尚未得到彻底评估。大多数流行的与下尿路功能障碍 (LUTD) 相关的动物模型研究都集中在膀胱过度活动症上，但也有少数 DU 模型被报道25. 2002 年，国际自控协会 (ICS) 将逼尿肌活动不足 (DU) 定义为逼尿肌收缩的强度和持续时间降低。如果不及时治疗，长期存在的神经源性膀胱会导致尿路感染、肾积水甚至肾功能衰竭26.病因是多因素的，包括肌源性功能障碍或神经源性损伤27.关于神经源性因素，以往的研究大多集中在中枢神经系统损伤，如腰骶椎损伤28.然而，为了能够准确评估 SSNI（脊髓骶神经损伤）的新治疗方案，采用模拟真实临床症状的可靠且可重复的动物模型非常重要。然而，据我们所知，SSNI-DU 的临床相关动物模型尚未发表。 DU 的病理生理变化和可用的治疗策略仍不清楚，尽管在临床情况下并不罕见，并且比以前需要更多关注29.因此，我们开发了一种可靠的大鼠模型，该模型展示了周围神经瘢痕形成的基本病理过程。据我们所知，我们第一次通过用微型镊子挤压双侧脊髓骶神经，创建了一种新的逼尿肌活动不足的损伤动物模型。骶椎神经的挤压部位位于椎间孔附近的根部，脊神经离开椎骨的位置，以确保在相似的临床条件下进行手术，模拟骶神经损伤的临床情况，如脊柱裂、骶骨骨折和某些医源性因素。我们还进行了全面评估，从功能、成像、形态和分子水平方面评估 SSNI 模型的特征（图 1 和 2）。结果尿动力学测试。为了检查双侧脊髓骶神经的挤压损伤是否会影响排尿功能，我们进行了如郑等人先前描述的填充和排尿尿动力学实验。30（图 3a）。尿动力学测试参数显示各组之间存在显着差异（图 3b 至 f）。在 1 周和 4 周，粉碎组的泄漏点压力（LPP）远高于假手术组（图 3d；p < 0.0001）。此外，挤压组的最大膀胱容量（MBV）在两个不同点显着高于假手术组（图 3e p < 0.0001），这一发现与 LPP 结果一致。然而，挤压组的膀胱顺应性显着高于假手术组（图 3f；p < 0.0001）。这些结果表明双侧脊髓骶神经受压 科学报告|(2022) 12:10026 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13254-63图1。学习规划。雌性大鼠脊髓骶神经损伤的实验流程。图 2。脊髓骶神经损伤的外科手术。 (一个-C) 解剖皮肤并识别脊柱过程，将椎旁肌肉与椎骨分离。 (d) 确定了背侧骶孔。 (e) 脊髓骶神经 2 暴露。损伤可能导致逼尿肌去神经（副交感神经纤维），表明逼尿肌活动不足和尿潴留。假手术和挤压手术后没有老鼠死亡。超声检查。进行经腹超声以评估尿量（图3i）。膀胱呈暗色、低回声、椭圆形结构，周围组织呈明亮、高回声区（图 3g 和 h）。根据方法部分中提到的公式计算膀胱体积。在 1 w 和 4 w 时，crush 组大鼠的膀胱体积（0.5360 ± 0.1730 ml、0.2980 ± 0.1337 ml）显着高于假手术组大鼠（0.1140 ± 0.0422 ml、0.0880 ± 0.0349 ml）（图. 3j；p = 0.0007 < 0.001 和 p = 0.0094 < 0.01)。逆行尿路造影。膀胱填充造影剂的矢状面、冠状面和轴向图像如图 4a 和 b 所示。重建的膀胱图像显示在左侧面板中。使用红色虚线描绘最大矢状图像部分的轮廓。膀胱的体积由系统自动计算。 Crush组大鼠膀胱体积（1143±253.9 ml）明显大于假手术组大鼠（415.7±245.0 ml；图4f；p = 0.0062 < 0.01）。在粉碎组中观察到形态学变化，但在假手术组中未观察到（图 4c、e 和 f）。步态分析。为了评估两组大鼠的运动功能，我们进行了步态分析（图 5a 至 5n）。在许多先前关于下尿路综合征动物模型的研究中，这些动物也有下肢功能障碍，特别是在挫伤性脊柱损伤模型或脊髓圆锥横断模型等疾病模型中。然而，在本研究中，下肢运动在跑步平均速度（图 5i；p = 0.7060 > 0.05）、打印长度（图 5j；F = 2.215，p = 0.4867 > 0.05）、爪角体轴（图 5k；F = 2.999，p = 0.6420 > 0.05），打印区域（图 5l；F = 2.256，p = 0.3827 > 0.05），中间脚趾伸展（图 5m；F = 2.036， p = 0.6198 > 0.05）或脚趾散布（图 5n；F = 2.001，p = 0.0781 > 0.05）。在脊髓骶神经挤压模型中，下肢的运动功能不受影响。这些特征与真实临床情况密切相关，其中许多脊髓骶神经损伤患者仅具有下尿路症状而没有明显的下肢功能障碍。 科学报告|(2022) 12:10026 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13254-64图 3。1周和4周的尿动力学检查和超声检查结果。 (一个) 尿动力学测试程序的图解图像。 (b和C) 4 w 时尿动力学测试的 P-T 曲线。 (d-F) 损伤后1周和4周两组的漏点压力、最大膀胱容量和膀胱顺应性。 N = 10/组。 (G和H) 1 w 和 4 w 两组膀胱的超声轴向和矢状图像。超声测试在轴向位置测量膀胱宽度和深度，在矢状位置测量长度。比例尺：0.5 厘米。 (一世) 大鼠超声程序的图像。使用 2 – 10 MHz 线性阵列传感器测量异氟醚麻醉下两组大鼠的膀胱体积。 (j) 在 1 w 和 4 w 的超声检查中计算出的排尿后体积。数据d-G表示为平均值±SEM。显着性水平设定为*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001,****P < 0.0001。组织学评估膀胱。手术后 4 周 Masson 三色染色的组织学分析显示结缔组织明显增加，肌肉质量减少， 科学报告|(2022) 12:10026 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13254-65图 4。膀胱CT重建和计算体积。 (一个和b) 2组对比剂充盈膀胱3维重建，右侧插图从上到下分别为轴位、矢状和冠状位图像。 (C) CT透视显示膀胱的实时图像。 (d和e) 造影剂填充膀胱的矢状图像。 (F) 通过 CT 扫描计算的膀胱体积，N = 4/组。数据表示为平均值±SEM。显着性水平设定为**P < 0.01。正常组织结构（图 6a#1 到 a#4 和 6b#1 到 b#4）。 H&E 染色显示，与假手术组相比，挤压组膀胱壁明显增厚，逼尿肌萎缩（图 6c#1 至 c#4 和 6d#1 至#4；p < 0.01，p < 0.01）。高倍显微镜下，crush组可见膀胱壁血管舒张和炎症浸润，而sham组则无（图6c#1～c#4和6d#1～d#4）。同时，胶原蛋白1/3的免疫荧光显示神经损伤后胶原蛋白发生移位（图6e#1至#4、6f.#1至#4、6g#1至#4和6h#1至#4） ，与假手术组相比，crush 组的膀胱重量在 1 周时增加，在 4 周时几乎翻了一番（图 6i；p < 0.05 和 p < 0.001）。与假手术组相比，Crush 组的膀胱壁厚度显着增加（图 6j；p < 0.05 和 p < 0.01）。胶原蛋白 1 与胶原蛋白 3 的比例在 4 周时显着增加（图 6k，p < 0.001）。此外，粉碎组的结缔组织与肌肉质量的比率在 4 周而不是 1 周时显着大于假手术组（图 6l；p < 0.001）。脊髓骶神经的组织学评估和免疫荧光染色。为进一步评价脊髓骶神经轴索变性和脱髓鞘情况，采用H&E染色和免疫组化染色显示脊髓骶神经的雪旺细胞和轴突。与假手术组相比，H&E 显示脊髓骶神经的正常结构丧失（图 7a#1 至 a#3 和 b#1 至 7#3）。免疫荧光染色