血管紧张素 II 受体阻滞剂对内皮功能的多效性激活对其保护性抗血管重塑作用至关重要

科学报告|(2022) 12:9771| https://doi.org/10.1038/s41598-022-13772-31 打开多效激活内皮功能血管紧张素 II 受体阻滞剂对其保护性抗血管重塑作用至关重要Arash Y. Tehrani1,2, Zoe White1,2, Lin Wei Tung3, Roy Ru Yi Zhao1,2, Nadia Milad1,2, Michael A. Seidman1,4, Elodie Sauge1,2, Marine Theret3, Fabio M. V. Rossi3,Mitra Esfandiarei2,5、Casey van Breemen2 和 Pascal Bernatchez1,2没有直接增强慢性内皮一氧化氮 (NO) 释放的治疗剂，这通常与血管稳态有关。相比之下，血管紧张素 II (AngII) 受体 1 型(AT1R) 阻滞剂 (ARB) 可以减弱 AngII 介导的氧化应激，这通常会导致内皮 NO 生物利用度增加。在这里，我们研究了直接的、不依赖 AngII/AT1R 的 ARB 类对内皮 NO 释放的潜在影响，以及这可能如何导致主动脉壁稳态增强和内皮 NO 特异性转录组变化。用四种不同的 ARB 治疗小鼠，可将血管收缩性持续长期抑制高达 82%16 周和 2 周时为 63%，L-NAME 逆转了这种效应，并且在内皮 NO 合酶 (eNOS) KO 小鼠或血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利治疗的动物中不存在。在缺乏 AngII 或在 AT1R 表达减弱或与 AT2R 阻滞剂孵育的组织中，替米沙坦降低血管张力，支持 AngII/AT1R 非依赖性多效性。最后，替米沙坦能够抑制衰老和马凡综合征 (MFS) 相关的主动脉根部以 NO 敏感、不依赖 BP 的方式扩大，并纠正异常的 TGF-β 信号传导。主动脉组织的 RNAseq 分析确定了对替米沙坦的反应，主动脉壁的早期 eNOS 特异性转录组重编程。这项研究表明，ARB 能够以可能不涉及阻断 AngII/AT1R 通路的方式对血管舒张性 NO 释放产生主要影响。应研究更广泛的 ARB 预防性使用以及由替米沙坦激活的非 AngII/AT1R 通路的鉴定。血管内皮是由特殊细胞组成的复杂单层，可使血管张力、白细胞粘附正常化1, 血浆蛋白渗漏2, 平滑肌细胞增殖4, 和内皮下组织稳态5.内皮功能通常用于描述内皮的血管扩张和保护特性，主要由一氧化氮 (NO)、前列环素 (PGI2) 和内皮源性超极化 (EDH) 维持6. NO 是主要的内皮血管扩张剂和内皮功能的标志物，其生物利用度与血管稳态密切相关，而在高血压、动脉粥样硬化和主动脉瘤等各种心血管疾病的发病机制中观察到保护性内皮功能丧失和 NO 生物利用度降低7.组成型表达的内皮 NO 合酶 (eNOS) 是响应剪切应力或激动剂诱导的刺激的保护性血管 NO 的主要来源8.因此，改善 eNOS 调节和整体内皮功能的方法与血管疾病的治疗高度相关9.1加拿大不列颠哥伦比亚大学不列颠哥伦比亚大学心肺创新中心。 2加拿大不列颠哥伦比亚大学麻醉学、药理学和治疗学系，2176 Health Sciences Mall, Room 217, Vancouver, BC V6T 1Z3, Canada。 3不列颠哥伦比亚大学生物医学工程学院和医学遗传学系，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华。 4 加拿大安大略省多伦多大学健康网络实验室医学项目。 5美国中西部大学研究生院生物医学科学系，格伦代尔，亚利桑那州，美国。电子邮件：pascal.bernatchez@ubc.ca 科学报告|(2022) 12:9771 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13772-32他汀类药物具有多效性、内皮功能增强特性，尽管这是否在其对心血管疾病结果的影响中起重要作用尚不清楚12. ACE 抑制剂 (ACEi) 和血管紧张素 II (AngII) I 型受体 (AT1R) 阻滞剂 (ARB) 通常与提高 NO 生物利用度有关13 因为它们可以通过 AT1R 阻断来防止 AngII 的氧化应激增强作用并减少 NO 清除14.然而，从未报道过 ARB 是否对内皮的血管舒张特性有直接的影响。我们已经证明 ARB 氯沙坦在 AT1R 受体表达减弱的马凡综合征 (MFS) 小鼠中保留了其抗主动脉根部扩张作用15，以及慢性氯沙坦期间高水平的内皮功能激活16和缬沙坦17治疗，突出了 AngII/AT1R 独立多效性的潜在存在。在本报告中，我们在小鼠中显示，ARB 具有增加内皮功能数月的能力，远远超过在相同降压水平上观察到的血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEi) 卡托普利。此外，多效性 ARB 替米沙坦可在数分钟内直接降低离体无 AngII 或正常 AT1R/2 信号传导的离体主动脉血管的血管张力，L-NAME 或使用 eNOS KO 动物完全消除了这种作用。我们还表明，替米沙坦触发的 NO 释放对于其在年龄和 MFS 相关主动脉根部扩大的环境中的前主动脉稳定性作用至关重要，并且它促进了脉管系统的 eNOS 特异性转录组重编程。总体而言，我们提供的证据表明，ARB 能够对 NO 依赖性内皮功能产生重大影响，而与它们阻断经典 AngII/AT1R 信号传导和相关氧化应激的能力无关，从而导致血管稳态的独特状态。这支持此类药物在一系列血管疾病中的更广泛治疗用途，并可能导致。方法动物。雄性野生型 (WT) C57BL/6 和 eNOS KO 小鼠 (库存 00,664, 002,684) 购自杰克逊实验室并喂食常规 5001 食物，而 fibrillin-1 (FBN1) C1041G+. MFS 小鼠在不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会 (UBC ACC) 协议 #A16-0314 和 UBC 生物安全委员会 #B18-0068 的伦理批准下在内部培育。 UBC ACC 遵守加拿大动物护理委员会 (CCAC) 和 ARRIVE 指南，并带有 OLAW 保证 #F16-00068 (A5090-01)15. 6 周龄小鼠被随机分配接受氯沙坦（0.6 g L−1), 替米沙坦 (10 mg kg−1), 奥美沙坦 (5 mg kg−1), 缬沙坦 (30 mg kg−1), 替米沙坦 L-NAME (0.5 mg kg−1)15, 卡托普利 (25 mg kg−1) 或载体（饮用水） 2 或 18 周，直到分别在 8 或 24 周龄时处死。 ARB 以患者配方为基础，在圣保罗医院药房购买。逐渐调整替米沙坦和奥美沙坦的剂量，使血压降低与常用的氯沙坦剂量（0.6 g L−1) 在以前的研究中使用15，而缬沙坦以非降压剂量使用21.饮水中的药物每周更换 3 次，剂量根据体重不断调整，平均每笼每天饮水。无创血压测量和高分辨率超声成像。使用尾套 (CODA 2, Kent Scientific, Torrington, CT) 和 Vevo2100 系统 (MS550D 传感器, VisualSonics, FUJIFILM, Toronto, ON, Canada) 在非常轻或中等的条件下对小鼠进行无创血压测量和超声成像异氟醚麻醉（< 1% 或 2% v/v 异氟醚，1.5 L O2）。对于 BP 测量，将小鼠放在加热托盘上，将尾巴插入充气袖带。在 10 分钟的适应期以尽量减少变异性后，测量 15 个周期的 BP，并使用最后 10 个周期计算平均血压、收缩压和舒张压。使用多个 Valsalva 窦测量 (> 5) 以盲法对小鼠进行超声心动图并取平均值15在 12 或 24 周龄时。等距力的测量。在终末异氟醚麻醉下处死小鼠，然后进行颈椎脱位。降胸主动脉在冰冷的 Krebs 溶液中分离，如先前发表的 0.01 mmol L−1布洛芬抑制 PGI2 合成。将主动脉节段安装在肌动图仪（AS Danish Myotechnology，Denmark）上，如前所述拉伸至最佳张力（6.0 mN）30 分钟23，然后是两个 30 mmol L 的预收缩−1KCl，然后随着 PE 和乙酰胆碱 Ach（0.1 nmol L−1 至 100 μmol L−1) 分别用于收缩力和松弛度测量。对于直接刺激研究，主动脉环在替米沙坦（50 μmol L−1) 或 DMSO 载体在添加 PE 前在肌动描记器室中放置 30 分钟。剂量反应曲线用于计算 PE 和 Ach 的最大力 (Emax) 和灵敏度 (EC50)。通过与 L-NAME (200 μmol L−1， 30分钟）15和 ATR2 阻滞剂 PD123319（30 分钟；10 μmol L−1） 分别24, 在添加 PE 之前, 而 NO 敏感性是用硝普钠 (0.1 nmol L−1至 100 μmol L−1).主动脉 RNA 提取和基因表达谱分析。小鼠是用替米沙坦治疗 3 周的小鼠，它们的胸主动脉置于 400ul RNAsol (Sigma Aldrich) 中并匀浆 (OMNI International)。在异丙醇中过夜沉淀后提取 RNA，并以 1:20 的超酶重新悬浮在无 RNA 酶的水中。如前所述，使用 Agilent Bioanalyzer 2100 测试 RNA 样品完整性25. RNA-seq 数据的所有计算分析均在 R (v 3.6.1) 中进行。在至少两个样本中，每百万计数 (CPM) 低于 2 的基因被移除。在 sva 包 (v. 3.35.2) 下使用 Combat-seq 应用批量校正，将基因型和治疗指定为生物协变量26.使用 DESeq2 (v 1.24.0) 处理和分析批量调整的数据27设计公式考虑了基因型、治疗及其相互作用，包括归一化、主成分分析 (PCA) 和 Wald 检验差异表达分析。热图表示正则化的对数转换基因表达归一化 科学报告|(2022) 12:9771 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13772-33通过 Z 分数。使用 clusterProfiler (v 3.12.0) 进行通路富集分析 (Gene Ontology GO)28.对数转换的 p 值和映射到每个注释的基因数量在点图上描述。组织学。平行于房室平面平分，石蜡包埋的心脏在 Valsalva 窦处的整个主动脉根部被切割，如先前发表的那样15，用 Verhoeff-van Geison (VVG) 染色。使用 ImageJ 软件通过跟踪单个纤维并测量其长度（以像素为单位，然后转换为微米）来评估弹性纤维碎片29.使用 Aperio ImageScope 软件（Leica Biosystems，Wetzlar，Germany）通过测量 4 个内部和外部弹性蛋白层图像之间的平均距离来确定内侧增厚。对于免疫组织化学，切片进行抗原修复（10 mM 柠檬酸盐缓冲液，pH 6），内源性过氧化物酶淬灭，用 10% 正常山羊血清加 1% BSA 封闭 2 小时，并探测磷酸化 p44/42 MAPK（ERK 1/ 2) (Cell Signaling Technology, Cat# 9101S) 使用 DAB (Vector Laboratories) 和苏木精复染剂。蛋白质印迹。将来自用替米沙坦处理两周的 WT 小鼠的未固定冷冻心脏在裂解缓冲液中匀浆并离心16.蛋白质定量后，使用 SDS-PAGE 分离样品并转移到硝酸纤维素膜上。将膜切割至略低于 100kDs，顶部和底部部分被封闭，并在顶部膜上用 eNOS 的一抗（1:1000，Cell Signaling，Cat# 32027）和 T-AKT（1:1000 , Cell Signaling, Cat# 2920), p-AKT (1:1000, Cell Signaling, Cat# 4060), Cav-1 (1:1000, Santa Cruz Biote