第 493 号试验: 人重组雌激素受体 (hrER) 体外试验以检测具有 ER 结合亲和力的化学物质的基于性能的试验指南

Section4 健康影响 第493号试验指南 基于性能的人重组雌激素测试指南 受体(hrER)体外检测与ER结合的化学物质 亲和力 2024年6月25日 经合组织测试指南 化学品 通过： 2018年7月 18日 更正：2024年6月25日 经合组织化学品试验指南 基于性能的人重组雌激素受体（hrER）体外测定检测具有ER结合亲和力的化学物质的测试指南 一般介绍 基于性能的测试指南 1.该基于性能的测试指南(PBTG)描述了用于人重组体外测定以检测具有雌激素受体结合亲和力的物质(hrER结合测定)的方法。它包括两种用于鉴定雌激素受体的机械和功能相似的测试方法（i。Procedres.ERα）粘合剂，并应根据OECD指导文件（GD）中关于危险评估新的或更新的测试方法的验证和国际接受的验证原则（1），促进新的类似或修改的测试方法的开发。提供本PBTG基础的经过充分验证的参考测试方法（附件2和附件3）为： •使用全长人重组ERα（2）的Freyberger-Wilson（FW）体外雌激素受体（ER）结合测定 •使用人重组配体结合结构域蛋白的化学评价和研究所(CERI)体外雌激素受体结合测定(2)。 性能标准（PS）（3）可用于促进相同危险终点的类似测试方法的开发和验证，并允许及时修改此PBTG，以便可以将新的类似测试方法添加到更新的PBTG中。但是，只有在审查并同意满足性能标准后，才会添加类似的测试方法。本测试指南中包含的测试方法可以不加区分地用于满足各国对雌激素受体结合测试结果的要求，同时受益于数据的相互接受。 PBTG中包含的测试方法的背景和原理 2.经合组织于1998年发起了一项高度优先的活动，以修订现有的测试准则，并制定新的测试准则，以筛选和测试潜在的内分泌干扰化学品。2012年修订了经合组织关于测试和评估潜在内分泌干扰化学品的概念框架。原始和修订的CFs作为附件包含在《关于评估内分泌干扰化学品的标准化测试指南的指导文件》(4)中。CF包括五个级别,每个级别对应于生物复杂性的不同级别 。在该PBTG中描述的ER结合测定是水平2,其包括提供关于选择的内分泌机制/途径的数据的“体外测定”。该PBTG用于体外受体结合测试方法，旨在鉴定人雌激素受体α（ER。 3.已经清楚地证明了体外ER结合测定与生物学功能的相关性。ER结合测定被设计用于鉴定具有破坏雌激素途径的潜力的化学物质,并且在过去的二十年中已经被广泛地用于表征ER组织分布以及鉴定ER激动剂/拮抗剂。这些测定反映了配体-受 体相互作用，这是雌激素)信. 号传导途径的初始步骤，对于所有脊椎动物的生殖功能至关重要。 ©OECD（2024） 1 本文件以及此处包含的任何数据和地图均不影响任何领土的地位或主权，对 划定国际边界和边界，并以任何领土，城市或地区的名义。 您可以根据http://www.oecd.org/termsandconditions/上提供的条款和条件自由使用本材料 4.雌激素与ER的相互作用可影响雌激素控制基因的转录并诱导非基因组效应，这可导致细胞过程的诱导或抑制，包括细胞增殖、正常胎儿发育和生殖功能所必需的那些过程(5)(6)(7)。正常雌激素系统的扰动可能会对正常发育（个体发育），生殖健康和生殖系统的完整性产生不利影响。不适当的ER信号传导可导致诸如激素依赖性癌症的风险增加、生育能力受损以及胎儿生长和发育改变等效应(8)。 5.体外结合测定法基于物质与调节基因转录的特定受体配体结合位点的直接相互作用。人重组雌激素受体α（hrERα）结合测定法的关键组成部分测量放射性标记的配体（[3H]17β-雌二醇）在增加浓度的测试化学品存在下与ER结合（i。Procedres.竞争对手)。与对受体具有较低亲和力的那些化学品相比,对ER具有高亲和力的测试化学品在较低浓度下与放射性标记的配体竞争。该测定由两个主要部分组成:表征受体-配体相互作用参数和记录ER特异性的饱和结合实验,随后是表征测试化学品和放射性标记的配体之间结合ER的竞争的竞争性结合实验。 6.CERI和FW结合测定的验证研究已经证明了它们对于其预期目的的相关性和可靠性(2)。 7.本测试指南中使用的定义和缩写见附件1。 与受体结合测定相关的范围和限制 8.这些测试方法被提出用于筛选和优先排序目的，但也可以提供分子引发事件（MIE）的信息，可用于证据权重方法 。它们解决了在体外系统中与ERα配体结合结构域的化学结合。因此，结果不应直接外推到体内完整内分泌系统的复杂信号传导和调节。 9.天然配体17β-雌二醇的结合是一系列分子事件的初始步骤,其激活靶基因的转录并最终以生理变化结束(9)。因此,与ERα配体结合结构域的结合被认为是ER介导的内分泌破坏(ED)的关键机制之一,尽管存在可以通过其发生ED的其他机制,包括(i)与ER位点的相互作用。除了配体结合袋，（ii）与雌激素信号相关的其他受体的相互作用，ER和G蛋白偶联的雌激素受体，内分泌系统内的其他受体和酶系统，（iii）激素合成，（iv）激素的代谢激活和/或失活，（v）激素向目标组织的分布，以及（vi）从体内清除激素。 10.该PBTG解决了物质与人ERα结合的能力,并且不区分ERα激动剂或拮抗剂。该测定不解决进一步的下游事件如基因转录或生理变化。考虑到验证期间仅使用了单一物质，因此尚未解决对测试混合物的适用性。然而,该测试方法在理论上适用于多成分物质和混合物的测试。在对混合物使用测试指南以生成用于预期监管目的的数据之前，应考虑它是否可以为该目的提供足够的结果，以及为什么可以提供足够的结果。当存在对混合物测试的监管要求时,不需要这样的考虑。 11.无细胞受体系统没有内在的代谢能力，并且它们没有与代谢酶系统结合进行验证。然而，在研究设计中可能会纳入代谢活性，但这需要进一步的验证努力。 12.可能使蛋白质（即受体蛋白质）变性的化学物质，例如表面活性剂或可以改变测定缓冲液pH值的化学物质，可能不会进行测试，或者只能在没有 否则,可以在测试化学品的测定中测试的浓度范围受到其在测定缓冲液中的溶解度的限制。 为了提供信息，表1提供了在本PBTG中描述的两种完全验证的测试方法中测试的24种物质的测试结果。在这些物质中,根据公开的报道,包括ER转录激活的体外测定和/或子宫营养测定(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15),17种被分类为ER结合剂,6种被分 类为非结合剂。参考表1中总结的数据，两种测试方法对所有物质的分类达到10的几乎100％的一致性。-4附件2的hrER结合 测定性能标准(3)(表1、2和3)中提供了关于这组物质以及在验证研究期间ER结合测试方法中测试的其他物质的补充信息。 表1：当在FW和CERIhrER结合试验中测试时，物质分类为ER结合剂或非结合剂，并与预期反应进行比较 物质名称 CASRN 期望d尊重 e FW测定 CERI测定 MESH 化学类 产品类 浓度范围(M) 分类 浓度范围(M) 分类 1 17β-雌二醇 50- 28-2 Binder 1x10-11- 1x10-6 Binder 1x10-11– 1x10-6 Binder 类固醇 药学，兽药 2 无赖 68- 23-5 Binder 3x10-9- 30x10-4 Binder 3x10-9-30x10- 4 Binder 类固醇 药学，兽药 3 Norethindrone 68- 22-4 Binder 3x10-9- 30x10-4 Binder 3x10-9-30x10- 4 Binder 类固醇 药学，兽药 4 邻苯二甲酸二正丁酯 84- 74-2 非活页夹* 1x10-10- 1x10-4 非活页夹 1x10-10-1x10- 4 非活页夹 烃类(环状),酯 增塑剂,化学中间体 5 DES 56- 53-1 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 烃(环),苯酚 药学，兽药 6 17α-乙炔雌二醇 57- 63-6 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 类固醇 药学，兽药 7 Meso-Hexestrol 84- 16-2 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 烃(环),苯酚 药学，兽药 8 金雀异黄素 446-72-0 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 烃(杂环), 类黄酮 天然产物 9 Equol 531-95-3 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder Phytoestrogen 代谢产物 天然产物 10 对羟基苯甲酸丁酯 (正丁基-4- 羟基苯甲酸酯) 94- 26-8 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 对羟基苯甲酸酯 防腐剂 11 壬基酚(混合物) 84852 -15-3 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 烷基酚 中间体化合物 12 o,p'-滴滴涕 789-02-6 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 有机氯 杀虫剂 13 皮质酮 50- 22-6 非活页夹* 1x10-10- 1x10-4 非粘合剂 1x10-10-1x10- 4 非粘结剂 类固醇 天然产物 14 玉米赤霉烯酮 17924 -92-4 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 碳氢化合物 （杂环），内酯 天然产物 15 他莫昔芬 10540 -29-1 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 碳氢化合物(环状) 药学，兽药 16 5α-二氢睾丸激素ne 521-18-6 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 类固醇,非 酚 天然产物 17 双酚A 80- 05-7 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 苯酚 化学中间体 18 4-正庚基苯酚 1987- 50-4 Binder 1x10-10- 1x10-3 模棱两可a 1x10-10-1x10- 3 Binder 烷基酚 中间 19 开蓬(十氯酮 ) 143-50-0 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10- 3 Binder 碳氢化合物，（卤化 ) 农药 20 本奔驰(a)炭疽e 56- 55-3 非活页夹 1x10-10- 1x10-3 非粘结剂 b 1x10-10-1x10- 3 非粘结剂 b 芳香烃 中间 2 肠内酯 78473 -71-9 Binder 1x10-10- 1x10-3 Binder 1x10-10-1x10 - 3 Binder Phytoestrogen 天然产物 22 孕酮 57- 83-0 非活页夹* 1x10-10- 1x10-4 非粘结剂 1x10-10-1x10 - 4 非粘结剂 类固醇 天然产物 23 辛基三乙氧基硅烷 ne 2943- 75-1 非活页夹 1x10-10- 1x10-3 非粘结剂 1x10-10-1x10 - 3 非粘结剂 硅烷 表面改性剂 24 阿特拉津 1912- 24-9 非活页夹* 1x10-10- 1x10-4 非粘结剂 1x10-10-1x10 - 4 非粘结剂 杂环化合物 除草剂 *溶解度极限<1x10-4M. *邻苯二甲