体外诊断试剂产品注册技术审评报告

受理号：CSZ2100047 体外诊断试剂产品注册技术审评报告 产品中文名称：乙型肝炎病毒核糖核酸（HBVRNA）检测试剂盒 （PCR-荧光探针法）产品管理类别：第三类 申请人名称：圣湘生物科技股份有限公司 国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心 —1— 目录 基本信息3 一、申请人名称3 二、申请人住所3 三、生产地址3 技术审评概述4 一、产品概述4 二、临床前研究概述6 三、临床评价概述12 四、产品受益风险判定14 综合评价意见17 —2— 基本信息 一、申请人名称 圣湘生物科技股份有限公司 二、申请人住所 长沙高新技术产业开发区麓松路680号 三、生产地址 长沙高新技术产业开发区麓松路680号 技术审评概述 一、产品概述 （一）产品主要组成成分 本试剂盒包括逆转录、荧光PCR扩增反应试剂，主要组成成分见表1。 表1主要组成成分 序号 试剂名称 规格与装量 主要成分 1 HBVRNA反应液 588μL/管×1管 引物、探针、dNTPs、PCRbuffer 2 HBVRNA酶混合液 96μL/管×1管 Tth酶、Taq酶 3 RT增强剂 50μL/管×1管 硫酸锰 4 HBVRNA定量参考品A 500μL/管×1管 含目标片段的假病毒 （3.00E+07copies/mL） 5 HBVRNA定量参考品B 500μL管×1管 含目标片段的假病毒（3.00E+06 copies/mL） 6 HBVRNA定量参考品C 500μL/管×1管 含目标片段的假病毒 （3.00E+05copies/mL） 7 HBVRNA定量参考品D 500μL/管×1管 含目标片段的假病毒（3.00E+04 copies/mL） 8 HBVRNA阴性对照 500μL/管×1管 灭活的阴性血清 9 HBVRNA阳性对照 500μL/管×1管 含目标片段的假病毒 10 HBVRNA内标 50μL管×1管 含内标片段的假病毒 备注： 1.不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。 2.本试剂盒定量参考品溯源至制造商选定测量程序。 3.自备试验器材：无DNA酶、RNA酶的1.5mL离心管、 0.2mLPCR反应管；台式离心机；台式振荡混合器；磁珠分离器、各种规格的加样枪及相应Tip头(10μL，200μL，1000μL)。所有的反应管都需经无RNase处理。 4.提取试剂盒使用本公司生产的核酸提取或纯化试剂（湘长械备20150021号）进行核酸提取。 （二）产品预期用途 本试剂盒用于体外定量检测临床血清样本中的乙型肝炎病毒（HBV）RNA。 乙型病毒性肝炎（乙肝）是由乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus,HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病，临床上以疲乏、食欲减退、肝肿大、肝功能异常为主要表现。人感染乙型肝炎病毒（HBV）后，病毒持续未被清除者可能发展为慢性肝炎，如果不进行适当的干预，约15％～40％的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者最终将发生肝硬化、终末期肝病及肝癌。因此，乙型肝炎病毒（HBV）感染者应积极进行抗病毒治疗，并监测其病毒载量变化。本试剂盒通过对经核苷（酸）类似物治疗、乙型肝炎表面抗原浓度低于1500IU/mL的病例，检测血清中乙型肝炎病毒（HBV）RNA， 用于该人群经核苷（酸）类似物联合干扰素治疗后乙型肝炎表面抗原转阴的提示。 （三）产品包装规格 24人份/盒。 （四）产品检验原理 本试剂盒通过逆转录HBV核酸中的pgRNA，利用针对HBVpgRNA序列设计的一组特异性引物与荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现HBVpgRNA的定量检测。 PCR检测体系含有阳性内对照（内标），通过检测内标基因来监测提取核酸中是否具有PCR抑制物，评价核酸提取的质量，避免PCR假阴性。 二、临床前研究概述 （一）主要原材料 1.主要原材料的选择 本产品在制备过程中主要原材料包括引物、荧光探针、dNTPs（T）、TthDNAPolymerase（Tth酶）、Taq酶、HBVRNA假病毒、HBVRNA内标假病毒等，主要原材料为外购方式获得。申请人选择有资质的供应商提供的原料，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商，制定了各主要原材料的质量标准并经检验合格。 2.企业参考品和对照品的设置情况 本产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、线性参考品、检出限参考品和精密度参考品。参考品采用临床样本和假病毒制备而成。组成如下： 阳性参考品6份（P1～P6）：由含不同乙肝病毒型别（B型、C型、D型）与浓度的6份乙型肝炎病毒核糖核酸（HBVRNA）阳性样本组成。 阴性参考品8份（N1～N8）：N1～N3为正常人乙型肝炎病毒阴性血清样本；N4～N8为种属相近的或引起症状相似的病毒，分别为丙型肝炎病毒（两份）戊型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒阳性样本。 线性参考品8份（L0～L7）：由不同浓度的乙型肝炎病毒核糖核酸（HBVRNA）假病毒组成。经标定的乙型肝炎病毒核糖核酸（HBVRNA）强阳性假病毒，用阴性血清分别稀释至1.0 ×109copies/mL、1.0×108copies/mL、1.0×107copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×102copies/mL，即企业线性参考品L0～L7。 检出限参考品3份（S1～S3）：来源于1份乙型肝炎病毒阳性血清样本，使用企业线性参考品定值后，用阴性血清稀释至5000copies/mL，编号为S，使用时用阴性血清分别稀释至100copies/mL，50copies/mL和25copies/mL，编号分别为S1，S2和S3。 精密度参考品2份（R1～R2）：经标定的乙型肝炎病毒核 糖核酸（HBVRNA）强阳性假病毒，用阴性血清分别稀释至1.5 ×104copies/mL、1.5×102copies/mL两个浓度，编号R1和R2。本产品设置了HBVRNA阴性对照和HBVRNA阳性对照， 用于检测过程中试剂盒和仪器的质量控制。此外，PCR检测体系含有阳性内对照（内标），通过检测内标基因来监测提取核酸中是否具有PCR抑制物，评价核酸提取的质量，避免PCR假阴性。 （二）生产工艺及反应体系研究 申请人对生产工艺及反应体系的研究包括核酸提取方法研究、样本用量研究、核酸用量研究；对引物探针离心时间、不同温度和时间复溶等进行优化；对PCRbuffer、引物、探针、Taq酶、Tth酶、dNTPs（T）等的用量进行了优化；对HBVRNA反应液、HBVRNA定量参考品、HBVRNA阳性对照及HBVRNA内标在2-8℃不同保存时间进行研究；并对反应条件进行优化，包括逆转录温度、逆转录时间、预变性时间、退火和延伸温度、循环数的选择研究。 申请人通过企业内部研究试验，确定了最佳的生产工艺及反应体系。 （三）分析性能评估 本产品分析性能包括核酸提取方法研究、测量范围、准确度、检出限与定量限、精密度、分析特异性、包容性，申请人提交了三批试剂，在适用机型（ABI7500荧光PCR仪、SLAN-96P 全自动医用PCR分析系统、雅睿MA-6000荧光PCR仪）上的性能评估资料。 1.核酸提取 申请人使用HBVRNA阳性样本，使用圣湘的核酸提取或纯化试剂和凯杰（QIAampViralRNAMiniKit(50)）的提取试剂盒进行对比研究，结果核酸提取或纯化试剂与对照试剂无明显区别，相对提取效率高。 2.测量范围 申请人使用HBVRNA强阳性血清为初始样本，用阴性血清稀释至1.0×109copies/mL～1.0×102copies/mL，分别使用三批质检合格的试剂盒进行检测，结果均符合线性范围的性能要求。 3.准确度 申请人将乙型肝炎病毒RNA检测试剂国家标准品稀释100倍后作为待测样本，分别使用三批质检合格的试剂盒进行检测，结果样本浓度对数值与理论对数值的绝对偏差均不超过±0.5个对数数量级，符合准确度的性能要求。 4.检出限与定量限研究 将已定值的HBVRNA阳性样本用阴性血清进行梯度稀释，分别使用三批质检合格的试剂盒进行检测，确定本试剂盒的最低检出限为50copies/mL，定量限为100copies/mL。使用三批质检合格的试剂盒对不同型别（B型、C型、D型）的HBVRNA 阳性样本进行检出限与定量限的验证，结果均符合检出限与定量限的性能要求。 5.分析特异性研究 以正常人乙型肝炎阴性血清，丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒、甲型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、甲型流感病毒、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、HIV、梅毒、痤疮丙酸杆菌、人类疱疹病毒6型及HBVDNA阳性样本作为待测样本，使用三批质检合格的试剂盒在适用仪器上检测，检测结果均为阴性，说明试剂盒具有很好的特异性。 在内源/外源干扰物质研究中，采用三批质检合格的试剂盒，对各种可能的干扰物质进行评价。结果显示血红蛋白（≤2g/dL）、总胆红素（≤28mg/dL）、甘油三酯（≤3g/dL）、总 IgG（≤40mg/mL）、干扰素2（a9ng/mL）、拉夫米定（300μg/mL）、 干扰素2b（250ng/mL）、恩替卡韦（100μg/mL）等对试剂盒的检测结果无影响。 6.精密度研究 选择HBVRNA阴性样本、HBVRNA临界阳性样本、HBVRNA弱阳性样本、HBVRNA强阳性样本作为待测样本，分别使用三批质检合格的试剂盒进行检测，进行为期21天的检测，结果显示三批试剂盒检测HBVRNA阴性样本的阳性检出率均为0%，检测临界阳性检出率均为100%。对于检测弱阳性及强阳性样本，三批试剂盒日间、不同操作者间、不同设备间、不 同试验地点间检测强阳性样本的浓度对数值CV均小于5%；弱阳性样本的浓度对数值CV均小于10%，符合精密度的性能要求。 7.包容性研究 选择不同型别（B型、C型、D型）HBVRNA高、中、低及检出限浓度样本，分别使用三批质检合格的试剂盒进行检测，结果高、中、低浓度样本检测浓度平均对数值的绝对偏差均不超过±0.5个对数数量级，高、中浓度对数值的CV值均不超过5%，低浓度对数值的CV值不超过10%，检出限浓度样本均为阳性，符合包容性的性能要求。 （四）阳性判断值研究 1.阳性判断值研究-准确性部分 选择已确认的HBVRNAB、C、D型阳性样本分别52份、54份、11份和60份临床HBVRNA阴性血清样本，用质检合格的HBVRNA试剂盒进行检测，然后进行ROC曲线分析，确定目标基因检测的Ct阳性判断值为40。 2.阳性判断值研究-有效性部分 本次研究对82位受试者（接受NAS联合干扰素抗病毒治疗，且同时满足HBsAg≤1500IU/mL，HBeAg阴性，HBVDNA定量低于检测下限的感染者）的血清样本进行HBVRNA定量检测，每位受试者采集2个标本，分别对应治疗开始时和治疗48周后两个不同检测点，检测其HBVRNA浓度。结果分析显示， 通过治疗开始时（第0周）血清中HBVRNA定量值预测治疗期（48周）血清样本中HBsAg阴转受试者工作特征曲线（ROC）分析，得出HBVRNA检测浓度对提示NAs联合干扰素治疗后HBsAg阴转的阈值为624.5copies/mL，此时灵敏度为84.8%，特异性为69.4%。 （🖂）稳定性研究 申请人对本产品的货架稳定性、加速破坏稳定性、冻融稳定性、开盖稳定性、运输稳定性进行了研究，同时，对样本的稳定性也进行了研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。 货架稳定性：将三批试剂储存于-20±5℃，分别在第0、3、6、9、12、13和14个月对试剂盒的外观、阴阳性符合率、最低检出限、线性、准确度、精密度进行考察，各项性能指标均符合要求。结果表明：本试剂盒在-20±5℃条件