扫描电子显微镜和宽氩离子束研磨的组合提供了木本植物次生组织的完整结构

科学报告|(2022) 12:9152| https://doi.org/10.1038/s41598-022-13122-31 打开扫描电子的组合显微镜和宽氩离子束研磨提供木本植物次生组织的完整结构波多野智宏1,2, Satoshi Nakaba3,4, Yoshiki Horikawa3,4 & Ryo Funada3木本植物的次生组织由脆弱的细胞和坚硬的细胞壁组成。然而，在电子显微镜分析的机械横截面过程中，这些结构很容易损坏。宽氩离子束 (BIB) 铣削通常用于硬质材料的扫描电子显微镜 (SEM)，以生成大且无变形的横截面。然而，BIB 铣削很少用于植物科学。在本研究中，SEM 结合 BIB 铣削被验证为一种准确的工具，用于对两种样品的次级木本组织进行结构观察，即活松 (Pinus densiflora) 和高密度橡木 (Quercus phillyraeoides)，并与经典切片机横截面进行比较。 BIB 铣削方法不需要环氧树脂包埋，因为样品的预先化学固定和临界点干燥，从而产生三维图像。结果表明，木质部结构在自然状态下保存完好。BIB 铣削的横截面与切片机横截面的比较。使用 SEM 与 BIB 研磨相结合的观察对于植物硬组织和软组织的大面积成像很有用，而透射电子显微镜很难观察到这些组织，因为很难获得这些组织的切片，特别是那些易碎的反应木材的切片。木材是主要的陆地碳生物质1 既用作碳中性材料又用作能源。了解次生木质部的完整超微结构至关重要，因为它与木材质量有关2.然而，木本植物具有三维（3D）异质和微观结构，这些解剖结构的成像方法需要高分辨率4.透射电子显微镜（TEM）比其他技术具有更高分辨率的成像性能，它提供了大量关于次生细胞壁超微结构及其形成过程的信息5.与使用 TEM 或透射光显微镜观察单个组织切片相反，扫描电子显微镜 (SEM) 观察可提供大面积的高分辨率和立体信息，有助于了解木材形成和微观结构的模式9. TEM 并不总是适合观察细胞壁的微纤维，因为多糖不规则地与染色剂中的重金属离子结合12.出于这个原因，SEM 经常被用作检查纤维素微纤维在高等植物细胞壁中的取向的替代方法12.然而，在横截面生物组织的显微观察中，传统的切片机切片方法需要用环氧树脂包埋。此外，高密度木材的机械切片通常需要通过化学处理或煮沸预先软化15.即使经过这种软化过程，通常也很难产生用于显微镜观察的高质量和大面积横截面17.此外，在 SEM 观察中，用环氧树脂嵌入会导致深度和信息的损失。基于溅射的离子束铣削方法在电子显微镜中用于分析硬质材料，因为它可以提供无应力和无应变的机械切割平面18.此外，带有镓离子源的聚焦离子束 (FIB) 允许精确铣削。因此，使用 FIB-SEM 进行断层扫描1 东京农业技术大学联合农业科学研究科，日本东京府中西外町 183-8509。 2JEOL Ltd., Musashino, Akishima, Tokyo 196-8558, 日本。 3东京农工大学农学系，日本东京府中西外町 183-8509。 4东京农业科技大学全球创新研究所，日本东京府中晴海町 183-8538。电子邮件：thatano@jeol.co.jp； funada@cc.tuat.ac.jp 科学报告|(2022) 12:9152 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13122-32图1。宽氩离子束 (BIB) 铣削的密花松径向切片的扫描电子显微镜结果 (一个) 和 BIB 铣削过程的图示 (b）。使用 BIB 铣削工艺，广泛从韧皮部到木质部的横截面没有切割缺陷和变形。树脂管可以很容易地与相邻的管胞区分开来，因为树脂在背散射电子图像中显示出高对比度。红框区域对应于图 2a。 Ca，形成层； Ph，韧皮部； R，树脂管； T，管胞； Xy，木质部。比例尺 = 100 μm。细胞器的 3D 重建21.然而，FIB 只能处理小面积，限制了其对大样本的使用23.因此，宽氩离子束 (BIB) 铣削可应用于横截面 SEM 分析，广泛用于硬质材料的取样24. BIB 铣削工艺可以在几毫米的材料上进行并调整到所需的深度26;因此，它适用于扫描电镜前的横截面预处理。此外，与 FIB 铣削相比，BIB 铣削产生的横截面损伤非常低27.在 BIB 铣削系统上设置样品非常容易，待加工的横截面位于从屏蔽板突出数十微米的位置28.然后通过BIB辐照铣削突出部分。然而，BIB铣削不能精确定位横截面，因为必须手动调整从屏蔽板突出的部分。尽管 BIB 铣削适用于分析 SEM 图像，但很少有可用于生物样品的应用28.据我们所知，尚未使用 BIB 研磨技术对木本植物次生组织的 SEM 观察进行研究。这可能是因为离子束辐照 BIB 铣削会导致加工表面的热损伤，尤其是有机材料30.在本研究中，我们将 BIB 铣削方法与传统的切片机切片方法进行了比较，并验证了将 SEM 与 BIB 铣削相结合以观察两种木本植物（日本红松）的次生组织微观结构和反应木材的潜力。和 Quercus philly-raeoides（Ubame 橡木）。 P. densiflora 由具有厚细胞壁的管胞组成，其树脂导管系统具有软组织和空腔31. Q. phillyraeoides 具有高密度的硬木质部细胞，细胞壁较厚32.此外，Q．因此，使用切片机方法通过 SEM 进行横截面观察是困难的。鉴于上述特点，选择日本红松和乌巴梅橡树作为合适的材料，验证使用扫描电镜结合 BIB 铣削观察木本植物次生组织微观结构的有效性。还讨论了如何防止离子束辐照对样品的加热损坏，这是 BIB 铣削的一个缺点。结果通过 BIB 铣削制备的木质部到韧皮部的径向横截面。图 1a 显示了 P. densiflora 的 BIB 铣削径向横截面。在 BIB 研磨之前，我们对样品进行了化学固定和临界点干燥。图 1b 是 BIB 铣削过程的示意图。 BIB 铣削工艺创造了从木质部到树皮的无变形横截面。因为松脂富含不饱和脂肪酸，会与四氧化锇发生反应33，树脂管在背散射电子图像中显示出高对比度。机械横截面经常分离形成层；然而，这种分离并没有发生在 BIB 铣削的横截面中（图 1a）。通过 BIB 铣削和切片法制备的径向实质次级韧皮部细胞的结构。图 2 显示了通过 BIB 铣削和切片法制备的次生韧皮部薄壁组织细胞的径向横截面。 BIB 研磨方法导致细胞器和细胞内储存材料的精细结构保存（图 2a）。在没有环氧树脂包埋的 BIB 研磨截面中观察到细胞核、淀粉颗粒和油体。此外，由于没有包埋环氧树脂，油体呈天然球形。原生质被观察为固定细胞内储存材料的3D网络结构。由于含有无机盐和水的细胞液渗漏，液泡出现空洞34在临界点干燥过程中。在切片机横截面中，淀粉颗粒在切割过程中通过机械应力从环氧树脂中分离出来（图 2b）。通过环氧树脂包埋，油体变形为无定形球体，原生质 3D 网络 科学报告|(2022) 12:9152 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13122-33图 2。密花松次生韧皮部薄壁组织细胞径向切片。 (一个) 宽氩离子束铣削的径向截面（图 1a 中的红框区域）。细胞核、原生质 3D 网络和细胞内储存材料（如淀粉颗粒和油体）显示出良好的结构保存性，而不会造成研磨损伤。油体呈天然球形，由于未进行环氧树脂包埋，所以空泡是空洞的。 (b) 径向切片机部分。在切片机切割过程中，通过机械应力将淀粉颗粒与原生质分离。油体因环氧树脂包埋而变形，因此呈现不规则的形状，细胞结构的SEM图像失去了深度信息。 N，核； O、油体； P，原生质； S、淀粉颗粒；五、液泡。比例尺 = 20 μm。作品和液泡被观察为平面图像（图2b）。相比之下，由于不需要环氧树脂包埋，BIB 铣削方法产生了木质部组织的 3D 信息。树脂管的横断面。图 3 显示了使用 BIB 铣削和切片机方法制备的树脂管和实质细胞（上皮细胞、射线细胞和轴向细胞）的横截面。在没有机械应力的情况下制备的 BIB 铣削横截面中，我们观察到包括韧皮部、形成层和木质部在内的广阔区域，包括树脂管（图 3a）。细胞内容物很容易识别，因为没有进行环氧树脂包埋（图 3a）。树脂管进一步放大显示，薄壁细胞薄壁没有被压扁，细胞内部充满了许多球形油体和淀粉颗粒（图3b）。封闭在薄细胞壁内的树脂通道和空隙空间保留了它们的结构（图 3b）。相反，在切片机截面中，树脂通道和空隙空间被机械应力压碎，油体由于环氧树脂包埋而呈现为无定形球体（图3d）。此外，在切片机横截面中，环氧树脂由于松脂渗透而具有高对比度，并且细胞内储存材料的 SEM 图像被遮挡（图 3d）。此外，因松脂渗出而劣化的环氧树脂与管胞分离（图3c，d）。反应木材的横截面观察。图 4 和图 5 显示了 P. densiflora 压缩木材和对面木材（非反应木材）中管胞的横截面。对面木被定义为位于倾斜树干处形成的反应木对面的木质部36.在 BIB 铣削的横截面中，压缩木材管胞呈圆形，具有厚细胞壁、螺旋腔和许多细胞间隙（图 4a、b、5a）。高度木质化的 S2 层显示出光滑的切割面，没有观察到 S1 和 S2 层之间的闪电裂缝或分离（图 4b、5a）。对面木材的管胞显示薄的矩形或六角形细胞壁。此外，单个管胞之间没有细胞间隙（图4c，d）。在压缩木材的切片截面中，结构沿切割方向延伸；结果，破碎的螺旋腔暴露在切割部分的表面上（图4e，f）。在压缩木材的刀片切割截面中，次生墙S2层产生许多裂缝，这些裂缝因切割而从次生墙的最外层（S1层）脱离（图4g，h， 5b)。图 6 显示了 Q. phillyraeoides 张力木材的横截面。在 Q. phillyraeoides 的凝胶状纤维中，BIB 铣削起源于光滑和宽阔的切割表面（图 6a，b）。凝胶纤维的细胞腔在张力木材中小于在非反应（相反）木材中的细胞腔（图 6a-d）。在 BIB 铣削的横截面中没有观察到椭圆形 G 层由于切割引起的损伤而显示出脱离（图 6b）。相比之下，在凝胶状纤维的切片横截面中，机械应力将 G 层从次生壁上挤压和分离（图 6f），并且细胞壁收缩很大（图 6e）。在剃刀刀片切割的张力木材横截面中，机械应力使大部分 G 层与正常的次生壁分离（图 6g，h）。 科学报告|(2022) 12:9152 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13122-34图 3。密花松树脂管和木质部薄壁细胞的横切面。 (一个,b) 宽氩离子束 (BIB) 铣削横截面。 BIB 铣削从韧皮部、形成层和木质部（包括树脂管）创建了一个宽而光滑的横截面。 (b) 薄壁细胞（上皮细胞、射线细胞和轴向细胞）含有许多油体 (O)，细胞壁比相邻的管胞薄。在 BIB 研磨的横截面中没有观察到薄细胞壁的破碎或淀粉颗粒的分离。 (C,d) 切片机横截面。由于环氧树脂嵌入，油体变形为模糊的轮廓。由于松脂渗出，环氧树脂与管胞分离。细胞内储存材料的扫描电子显微镜图像因树脂渗入环氧树脂而变得模糊。由薄细胞壁包围的树脂通道和空隙空间被机械应力压碎。 Ca，形成层； N，核； O、油体； R，树脂管； S、淀粉颗粒；五、空隙空间。比例尺 = 100 μm (一个和C) 和 20 μm (b和d).讨论据我们所知，这是第一项使用 BIB 铣削在没有环氧树脂包埋的情况下制备木本植物次生组织横截面的研究。此外，当与 BIB 铣削相结合时，SEM 提供了对次生木质部细胞的准确结构观察，因为在铣削过程中未施加机械应力。在 BIB 照射期间控制样品加热在生物样品研磨过程中至关重要。因此，我们将 BIB 铣削样品安装在薄铜箔上，以防止离子束加热的影响（图 1b）。薄铜箔附着在 BIB 铣削系统的屏蔽板上，将热量从样品传递到屏蔽板上。使用此程序，在 4 kV 的加速电压下，BIB 照射期间的样品温度可以抑制到大约 40 °C37.分泌树脂的薄壁细胞具有脆弱的薄壁，容易因