研究人员指南 ： 高分子晶体生长

高分子晶体生长国家航空航天局研究人员指南 ： 本国际空间站 （ ISS ） 研究人员指南由 NASA ISS 计划科学办公室出版。作者:Laurel J. Karr, 博士 Teresa Y. Miller, M. S. David N. Donovan执行编辑 ： Amelia Rai 技术编辑 ： Neesha Hosein 设计师 ： Cory Duke盖和后盖:a.在 STS - 95 期间通过温度诱导分批方法在蛋白质结晶设施内生长的重组人胰岛素晶体 (照片由伯明翰阿拉巴马大学提供; 出版物 Smith, Ciszak 等人, 1996 年) 。b.用于微重力的增强型扩散控制结晶装置。 （ 照片由 NASA 马歇尔太空飞行中心提供。 ）c.高密度蛋白质晶体生长。 （ 图片由阿拉巴马大学伯明翰分校提供。 ）2 实验室是开放的以每秒近 5 英里的速度绕地球运行，存在一个几乎相当于足球场大小的结构，重约一百万磅。国际空间站 （ ISS ） 是国际合作和工程重大成就的证明。除此之外，ISS 是一个真正独特的研究平台。通过对国际空间站进行研究可以发现的可能性是无穷无尽的，并且有可能为地球上更大的生命做出贡献，并激发后代的研究人员。随着我们越来越多地利用国际空间站作为国家实验室 ， 现在是时候让研究人员提出新的研究 ， 并发现揭示使用传统方法无法定义的关于自然的新知识。CASIS 赞助的实验在 SpaceX 3 上飞往国际空间站，并在 SpaceX 4 上返回地球。中子衍射结构测定需要大的蛋白质晶体。含有在太空中生长约六个月的无机焦磷酸酶晶体的石英毛细管 （ A ） 和在地球上生长的晶体 （ B ） 。毛细管的直径为 2mm 。在偏振光下显示了在空间中生长的典型晶体 （ C; Ng，Baird 等人。2015).3 44 5国际空间站研究环境的独特特征1.微重力失重或失重改变了物理和生命科学中许多可观察到的现象。受微重力影响的系统和过程包括表面润湿和界面张力，多相流和传热，多相系统动力学，凝固以及火灾现象和燃烧。微重力诱导了从细菌到人类的生物体的大量变化，包括基因表达的整体变化和细胞的 3 - D 聚集成组织样结构。2.极端条件在国际空间站环境中 ， 包括暴露于极端高温和低温循环、超真空、原子氧和高能辐射。暴露于这些极端条件的材料的测试和鉴定提供了数据 ， 使制造地球上使用的可靠组件以及世界上最先进的卫星和航天器组件。3. 低地球轨道倾斜 51 度和 90 分钟的轨道为国际空间站提供了一个独特的有利位置 ， 高度约为 240 英里 （ 400 公里 ） ， 轨道路径超过地球人口的 90 ％ 。与典型的地球遥感卫星的太阳同步轨道相比 ， 这可以提供更高的空间分辨率和可变的照明条件。5 目录实验室是开放的3国际空间站研究环境的独特特征5为什么大分子晶体生长和为什么在微重力 ？7微重力条件下大分子晶体生长简史11学生参与17主要调查人员应该知道如何对国际空间站进行研究18大分子晶体生长实验 - 经验教训19大分子纯度、均一性和单分散性19硬件选择19所需样品体积20计划控制实验20结晶条件20国际空间站上提供的多用途设施21欧式抽屉架 (EDR)21加快空间站 （ EXPRESS ） 机架实验的处理21通用实验室有源低温 ISS 实验冰箱 （ GLACIER ）22气态氮气冷冻器 (GN2)22单储物柜热封闭系统 (STES)23商用冰箱培养箱模块 - 改装23储物柜培养箱 (MERLIN) 微重力实验研究24Polar24Kubik25商业通用生物处理设备 (CGBA)25微重力科学手套箱 (MSG)26光显微镜模块 (LMM)26Nanoracks 显微镜27高分子结晶硬件设计28晶闸管 (结晶器)28图像处理单元 (IPU)28溶液结晶观察设施 (SCOF)29蛋白质结晶研究设施 (PCRF)29纳米机架 - 蛋白质晶体生长 - 130格拉纳达结晶设施 (GCF)30蛋白质结晶诊断设施 (PCDF)31高密度蛋白质晶体生长 (HDP)31用于微重力的增强型扩散控制结晶装置 （ EDCAM ）32有效载荷开发过程33大分子晶体生长实验的接触33融资机会36引文376首字母缩略词45 为什么高分子晶体生长和为什么在微重力?尽管在微重力中生长的大分子晶体由蛋白质，DNA，RNA 甚至整个病毒组成，但绝大多数大分子晶体都是蛋白质。人体内有超过 100, 000 种蛋白质，在全球环境中估计有 100 亿种。蛋白质具有许多功能，包括维持身体组织和器官的结构，功能和调节，并提供化学反应，细胞间信号传导和免疫反应的催化。为了充分了解它们的工作原理以及它们之间的相互作用，有必要确定它们的 3 - D 结构。这通常是通过分析优质晶体的 X射线衍射来完成的。一种使用中子衍射分析的较新方法，可以确定氢在蛋白质结构中的位置，并可以更准确地确定蛋白质内部和蛋白质之间发生的生化反应的机理 （ Blaeley，Laga 等人。2008 年，Niimra 和 Ba 2008) 。中子衍射需要非常大的质量晶体，大于 1 毫米。3在数量上，在大多数情况下。与超过 90, 000 个 X射线衍射结构相比，蛋白质数据库中已报道了少于 100 个独特的蛋白质中子结构。图 1 显示了蛋白肌红蛋白的中子衍射衍生结构。用于 X射线衍射和中子衍射结构确定的高分辨率数据需要高质量的晶体，几乎没有缺陷，这通常是晶体学家的瓶颈。特别难以生长具有所需质量的膜蛋白的高质量晶体，这一点由以下事实证明 ： 自 1985 年确定第一个结构以来，仅报道了 539 种独特结构 （ Deisehofer，Epp 等人。1985).据估计，所有基因组中所有基因的 20 - 30 ％ 是完整的膜蛋白 （ Kahsay，Gao 等人。2005 年 ），膜蛋白是 50 多个的靶标。 图 1. “中子 ” 。 （ 通过维基百科在公共领域下获得许可。 http: / / en. wikibooks. org / wiki / File: Neutron. jpg # / media / File: Neutron. jpg ）图 2. 累积的独特膜蛋白结构。 (http: / / blanco. biomol. uci. edu / mpstruc /)7 8所有现代药物的百分比 （ Overington ， Al - Lazikani 等人 2006 ） 。图 2 说明了自 1985 年以来膜结构测定的进展。基于基因组测序的成功 ， 2000 年 ， 美国国立卫生研究院的两个研究所 （ 国家普通医学科学研究所和国家过敏和传染病研究所 ） 合作资助了 9 个高通量结构测定试点研究中心。这些项目中的一个是确定与已经确定结构的蛋白质在序列中具有小于 30% 同一性的新结构 (Norvell 和 Berg 2007) 。这项为期五年的努力在 2005 年得到了更新和扩大。其他国家也开始了类似的举措。尽管许多蛋白质结构已提交给蛋白质数据库，但数字不如最初预期的高，并且与可溶性蛋白质的生产一起的瓶颈之一是成功的结晶 （ Grabowsi，Chrszcz 等人。2009).最成功的中心之一东北结构基因组学中心的最新统计数据显示，已经克隆了 25, 759 种蛋白质，纯化了 6, 407 种蛋白质，而其中只有 1, 480 种成功结晶 （ 23.3 ％ ； http ： / / www 。esg.org / statistics 。html).同样，中西部结构基因组学中心拥有 37, 012 个活性靶标和 3, 175 个晶体 （ 8.5 ％ ） 。其中，已确定 1, 843 个结构 （ http ： / / www 。mcsg.al.gov / ） 。蛋白质和其他大分子已经在微重力实验中结晶了三十多年。蛋白质晶体生长的第一个微重力实验是在 1981 年 ， 当时 Littke 进行了六分钟的微重力实验β- 德国 TEXUS 探空火箭上的半乳糖苷酶。该实验的视频显示了层流扩散过程 ， 而不是地球上发生的湍流对流 (Littke 和 John 1984) 。关于在微重力下生长大分子晶体的影响的优秀讨论已经发表并在报纸上发表 (Snell 和 Helliwell 2005 ， McPherson 和 DeLucas 2015) 。被认为是质量测量的晶体的一些特征包括视觉完美度和尺寸，分辨率极限，I / sigma 比 （ 本质上是信噪比 ） 和马赛克性。据信，影响微重力下晶体生长的因素包括缺乏浮力驱动的对流和缺乏沉降。Psey 等人。说明了在地球重力下生长的溶菌酶晶体的对流模式 （ 或生长羽流 ） （ 图 3 ； Psey，Witherow 等人。1988 ） 。在地球上 ， 对流流将大分子输送到生长中的晶体表面 ， 而在微重力下 ， 这些浮力驱动的对流流是 9 图 3. Schlieren 照片显示了在地球上生长的溶菌酶晶体周围的连续对流生长羽流形成 （ Pusey ， Witherow 等人 ， 1988 ） 。不存在，晶体周围的区域会耗尽大分子。因此, 向生长的晶体添加分子仅由扩散控制。据推测，晶体周围的耗尽区域会导致生长较慢，从而使晶体形成的缺陷较少，并且还会阻碍聚集体的添加 （ 因为较大分子的扩散较慢 ； Li，Roseberger 等人。1995 ； Li，Petsev 等人。2001).该耗尽区首先由 McPherso 可视化，并且全部在称为可观察蛋白质晶体生长设备的设备上使用马赫 - 正德干涉法 （ OPCGA ； McPherso，J.马尔金.等人。 1999 ） ， 该计划计划在国际空间站上使用 ， 但在航天飞机之后被取消哥伦比亚灾难。最近 ， 在高级蛋白质生长设施 （ APCF ； Otalora ， Garcia - Ruiz 等人。 2002 年 ） 和 Nano Step 实验 （ Yoshizaki ， Tsukamoto 等人。 2013 年 ） 中 ， 在国际空间站上对生长晶体周围的这些稳定耗尽区进行了可视化和记录。来自微重力大分子生长实验的许多公开报道描述了晶体的体积比以前在地面上生长的任何晶体都要大得多 ， 这给出了在整个分辨率范围内具有更高分辨率和 I / sigma 的 X射线衍射数据。表 1 提供了在微重力下晶体生长的大分子列表 （ 带有参考文献 ）图 4: 在地面和微重力下生长的四方溶菌酶晶体的马赛克性比较 (Snell, Weisgerber 等人 1995) 。提供了迄今为止在地球上生长的晶体的数据质量的显着改善。列表是ABCD 10并非包罗万象 ， 因为许多飞行的实验都是为了商业实体的利益 ， 所有这些结果都已经或将要发表是值得怀疑的。仔细测量晶体的马赛克性也显示出明显的改善在地球上生长的微重力晶体上生长。Sell 和他的同事于 1995 年首次报道了这一点，其中四方溶菌酶晶体在两个单独的穿梭任务中生长，其中他们证明了比地球生长的晶体提高了三到四倍 （ Sell，Weisgerber 等人。1995 年 ； 图 4 ） 。比较在 STS - 78 航天飞机任务中在欧洲航天局 （ ESA ） 高级蛋白质结晶设施 （ APCF ） 的透析反应器中生长的氨酰基 tRNA 合成酶的微重力晶体的结果相似 （ Ng，Sater 等人。2002 年 ） ， 并在 STS - 95 任务中使用微重力生长的胰岛素晶体 （ 在商业蛋白质结晶设施 [PCF] 中生长 ； Borgstahl ， Vahedi - Faridi 等人。 2001 ） 。将微重力中生长的晶体与在相同条件和相同设备中在地球上生长的晶体进行比较并不总是最好的比较，因为重力生长的最佳条件通常与微重力中的最佳条件不同。因此，对已发表结果的比较通常是在微重力实验中看到的最佳条件与地球实验室先前使用的所有条件之间进行的比较。有这么多的成功案例是相当了不起的，因为特别是在航天飞机时代的早期，微重力实验的硬件相对较少。最佳