2023年生物医药技术趋势展望

序言 生物医药是关系国计民生的重要产业，是当今世界创新最为活跃、发展最为迅猛的战略性新兴产业之一。新冠肺炎疫情全球大爆发更是凸显了生物医药的重要性，世界各国纷纷把生物医药技术及产业化提升作为国家战略。 随着生物技术的创新发展，许多创新性的技术经过多年的积累和研究的深入，逐步取得重大突破，促进了创新型药物的产业化，推动生物医药行业从具有发展潜力的高技术产业逐步转变为蓬勃发展的高技术支柱产业。 2023年，哪些生物医药技术在未来1-3年具备产业影响力、生物医药产业应用创新有哪些新趋势？ DeepTech密切关注行业发展最新动向，通过文献统计、数据分析、专家访谈等手段，洞悉生物医药技术发展趋势，探寻具备技术颠覆性、具有产业化前景的先进生物医药技术，并客观真实地阐述其发展现状，展望2023年十大生物医药技术趋势。 DeepTech正式发布《2023年生物医药技术趋势展望》研究报告。十项生物医药技术展望，涵盖了生命科学和生物医药的底层技术CRISPR-Cas基因编辑技术、酶促DNA合成、药物递送系统，从基础研究进入临床阶段的异种器官移植、CAR-NK细胞治疗、噬菌体疗法，实现赛道破冰的微生态疗法，以及实现产业化并将有更多创新突破的mRNA药物、抗体偶联药物、双特异性抗体。 2023年，生物医药技术新趋势将重塑产业发展格局，它们可能会对未来生物医药产业的研究方向产生重大影响。未来，生物医药底层技术的革新将推动创新药物从基础研究走向临床试验，并最终实现产业化，推动创新药物研究和生物医药产业发展进入革命性变化的时代，最终为人类的生命健康保驾护航。 基础技术篇 基础技术的突破不断引领生物医药创新前沿 基础技术的突破不断引领生物医药创新前沿。新型基础技术的出现和改进会引领相关领域爆炸式发展，加速临床应用和产业化进程，从而解决更多尚未满足的临床需求。CRISPR-Cas系统的发现引领了基因编辑领域突破性发展，技术改进将追求精准化、灵活化、迷你化，促进基因编辑疗法的临床应用。酶促DNA合成将引领新一轮的DNA合成技术革命，实现长片段DNA高效率、高精度、低成本合成，极大地拓展DNA的应用范围，推动合成生物学的巨大进步。药物递送系统是创新药物研发不可避免的话题，新型药物递送系统在不断涌现，大幅缩短创新药物研发周期，撑起创新药物研发的半边天。 标题 CRISPR-Cas系统是继ZFN、TALEN之后的第三代基因编辑技术。它的出现推动了基因编辑技术的发展，已经成为当今世界应用最广泛的基因编辑技术，成为生命科学最主要的底层技术之一。CRISPR-Cas9系统主要由Cas9蛋白和单链向导RNA(sgRNA)所组成，其中Cas9蛋白起切割DNA双链的作用，sgRNA起向导的作用。在sgRNA的向导下通过碱基互补配对原则，Cas9蛋白可对不同的靶部位进行切割，实现DNA的双链断裂。 根据CRISPR-Cas作用模块的数量和种类，CRISPR-Cas系统分为两大类。第一类CRISPR-Cas系统由多个Cas蛋白亚基组成的多蛋白效应复合物和crRNA组成，又可细分为I型、III型和IV型；第二类CRISPR-Cas系统为单一蛋白效应器，又可细分为II型、V型和VI型。目前，已经鉴定的CRISPR-Cas系统中，以第一类CRISPR-Cas系统为主，占比多达90%左右，广泛分布于细菌和古生菌中。由于第一类效应复合物由多蛋白组成，基因编辑过程复杂，实用性不佳。而第二类CRISPR-Cas系统由Cas蛋白发挥DNA或RNA的切割功能，切割靶序列效率高，且单个蛋白易于改造，因而第二类CRISPR-Cas系统被最早开发并广泛应用于基因编辑中。其中，最常用的是Cas9、Cas12a和Cas13a。 图1丨Cas9、Cas12和Cas13基因编辑原理图(来源：MolecularCell) Cas9是最早被发现和表征的二类II型效应蛋白，是目前应用最为广泛的Cas蛋白之一。Cas9是由crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)引导的DNA核酸内切酶。CRISPR序列转录为pre-crRNA，随后加工为成熟的crRNA，并与tracrRNA、Cas9蛋白形成核糖核蛋白复合体。当Cas9蛋白识别富含鸟嘌呤PAM序列(如NGG，其中N代表任意核苷酸)，并且crRNA与靶DNA序列互补，那么Cas9会在PAM序列上游约3-4个核苷酸对双链DNA进行切割，引发DNA双链断裂，形成平末端。 Cas12a，最早称为Cpf1，是二类V型效应蛋白，也是目前应用最为广泛的Cas蛋白之一。Cas12a同时具有DNA和RNA内切酶活性，可以不依赖于tracrRNA而将pre-crRNA加工为成熟的crRNA。Cas12a识别富含胸腺嘧啶的PAM序列(如TTN)，并在PAM序列下游对双链DNA进行切割，形成粘性末端。与Cas9和Cas12a不同，Cas13a是靶向RNA的核酸酶，属于二类VI型效应蛋白。Cas13a与crRNA、底物结合形成三元复合体后，Cas13a蛋白被激活，对底物单链靶RNA进行切割。 核酸酶 Cas9 Cas12a Cas13a 分类 II型 V型 VI型 核酸酶结构域 RuvCandHNH RuvC HEPN gRNA crRNA和tracrRNA crRNA crRNA 底物 dsDNA dsDNA RNA PAM G富含(如NGG) T富集(如TTN) - 裂解方式 平末端 粘性末端 取决于靶向序列和二级结构 表1丨常用Cas蛋白特征(来源：MolecularCell，DeepTech整理) Cas蛋白的固有缺陷限制了CRISPR-Cas系统的应用。PAM序列限制了靶目标的范围，如Cas9识别的PAM序列为NGG，在人类基因组中平均每八个碱基才有可能出现一个 PAM序列，严重制约了其对基因组大部分位点的编辑。脱靶效应也是CRISPR-Cas系统面临的一大问题，gRNA同靶序列的结合可以允许多个碱基的错配，这导致了基因编辑过程中会发生不可预测的脱靶，这对于精准的基因编辑来说是一个不可忽视的问题。另外，由于常用的Cas9、Cas12a和Cas13a大小接近4kb,而递送系统AAV病毒的包装上限约为4.7kb，不利于CRISPR-Cas系统的递送。这些问题都极大地影响了基因编辑的精准性、可控性、灵活性和安全性，限制了CRISPR-Cas系统新功能和应用范围的拓展。因此，优化改造Cas蛋白、寻找更小的Cas蛋白、发掘更优的新型系统等成为近年来CRISPR-Cas系统研究的重点方向。 优化改造Cas蛋白，提高基因编辑的精准性和灵活性。脱靶效应和PAM的序列限制是影响CRISPR-Cas系统应用的核心问题，因此需要对Cas蛋白进行优化改造，从而提高靶向特异性，克服脱靶率问题，并突破PAM限制，扩展靶序列的识别范围。目前，已经有众多工作开展，构建了多个Cas蛋白突变体。例如，通过合理设计并定向进化开发高保真的Cas9变体，得到高保真蛋白enAsCas12aHF1。新开发的两种Cas9变体SpG和SpRY，不需要特定的PAM来结合和切割DNA序列。 Cas蛋白迷你化提高CRISPR-Cas系统的递送效率。新开发的小型Cas蛋白Nsp2-SmuCas9嵌合体，长度约为1000氨基酸,可识别N4CPAM序列，但其编辑活性仍有待提高。迷你蛋白Cas14，又称为Cas12f1，只有400-500个氨基酸。近年，基于该蛋白又开发了多款迷你蛋白，如DpbCas12e(约1000氨基酸)、Cas12j(又称CasΦ，700氨基酸)、Un1Cas12f1(537氨基酸)、AsCas12f1(422氨基酸)、SpaCas12f1(497氨基酸)和CasMINI(源自Un1Cas12f1，529氨基酸)。不过这些蛋白还存在编辑活性低的问题，有待进一步改进。我国辉大基因开发了Cas13X.1(又称Cas13e.1，775氨基酸)和Cas13Y(又称Cas13f，790氨基酸)，并于2022年获得美国专利局授予专利，成为我国首个自主研发的、在美国获得专利授权的CRISPR-Cas13基因编辑工具，打破了欧美在基因编辑工具领域的专利垄断。 Cas蛋白变体 PAM序列 保真性 Cas蛋白变体 PAM序列 保真性 KKHSaCas9 NNNRRT — SpCas9-HF1 NGG 提高 RRAsCas12a TYCV — SpG NGN — RVRAsCas12a TATV — SpRY NYN/NRN — GAT/CAA CTCV/CCCV xCas9-3.7NG/NNG/GAA/ 提高enAsCas12a-HF1TTYN/VTTV/TRTV提高 SpCas9-NRRH/NRTH/NRCH NRNH提高LbCas12a-RVRRTNTN/TACV/TTCV/— 标题 HypaCas9 NGG 提高 BlackjackSpCas9 NGG 提高 eSpCas9(1.0) NGG 提高 表2丨部分工程化改造的Cas蛋白变体(来源：SyntheticBiologyJournal，DeepTech整理) 发掘新型Cas蛋白，扩大CRISPR-Cas系统的应用范围。Cas7-11是通过大数据挖掘找到的一类独特的III-E型CRISPR-Cas系统，与传统的多组分效应蛋白复合物不同，该系统具有单一的效应蛋白Cas7-11(由传统的Cas11和Cas7融合而成)，具有crRNA加工和序列特异性RNA切割活性，为哺乳动物细胞提供了一种新的RNA敲除工具，其脱靶效应比当前的RNA敲除技术更低。 2023年首个CRISPR基因编辑疗法有望获批上市。CRISPR-Cas系统的广泛应用推动了相关生物医药技术的发展。美国Vertex制药公司和CRISPRTherapeutics公司目前正在开发基于CRISPR-Cas9系统的exa-cel疗法，使用CRISPR-Cas9技术编辑有缺陷的基因系统治疗β-地中海贫血和镰状细胞病这两种遗传性血液疾病。2022年9月，基于良好的临床试验结果，Vertex公司和CRISPRTherapeutics启动exa-cel疗法的上市申请，有望于2023年获批上市。 酶促DNA合成是指在不依赖于DNA模板的情况下，通过酶促反应实现DNA分子的从头合成。这个技术的核心便是实现酶促反应的末端脱氧核苷酸转移酶(TerminaldeoxynucleotidylTransferase,TdT)。TdT是一种不依赖于DNA模板的单链DNA合成酶，整个催化过程中不需要经过变性、复性和延伸反应，在恒温和金属离子辅助的条件下，催化脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)聚合到寡核苷酸的3'末端，从而合成寡核糖核苷酸链。TdT具有无模板依赖的快速聚合活性，能够实现长链DNA合成。另外，TdT对底物的选择性较低，dNTP、核糖核苷三磷酸(rNTP)以及修饰的核苷三磷酸类似物均可以作为的TdT底物。 化学合成法在DNA合成长度、成本和环保等方面存有问题。目前，市面中最常用的DNA合成方法是固相亚磷酰胺三酯法。该化学合成法需要4-5个反应步骤，每个步骤可能会有错误，随着合成链的延长，合成的准确率会大幅下降，合成产物得率也明显下降。这导致化学合成法合成的DNA片段长度最多能达到200-300nt。若想得到更长的DNA片段，需要将短片段不断拼接组装，拼接组装过程大幅增加了长链DNA合成成本。另外，化学合成法需要大量使用有毒化学试剂，合成产生的废液、废气需要特殊处理。 酶促DNA合成技术推动DNA合成技术再次升级。酶促DNA合成技术只需要2-3个反应步骤，可以提高DNA合成的准确率，缩短DNA合成时间。酶的高特异性支持长片段DNA的合成，或能够合成长达8000nt的DNA序列，酶促合成技术有望将长片段DNA合成的成本降低2-3个数量级。酶促DNA合成反应在温和条件和水相中进行，整个催化合成过程绿色环保，不产生危险废物废液。与化学合成法相比，酶促DNA合