使用多重平行矿化技术生成具有非土壤载体的尖孢镰刀菌抑制土壤

科学报告|(2022) 12:7968| https://doi.org/10.1038/s41598-022-10667-11 打开镰刀菌的产生使用非土壤载体的尖孢菌抑制土壤多重平行矿化技术Jamjan Meeboon1、Akinori Ando2,3、Jun Ogawa2,3、Kenji Miyamoto4、Yasuo Kato5 & Makoto Shinohara1世界各地都存在抑制疾病的土壤。然而，疾病抑制机制尚不清楚，也不清楚如何生产这种土壤。在多重平行矿化系统 (MPM) 中发育的微生物群可以提高养分生产效率并减少根部疾病在水培系统中。接种MPM微生物的人工培养基可以降解有机物，产生类似于天然土壤的无机养分，但它们是否也能抑制病原体的生长尚不清楚。在这里，我们生产了一种人工培养基，它可以抑制病害，类似于抑制病害的土壤。将微生物MPM培养液接种到非土壤载体（岩棉、稻壳炭和蛭石）中，测试其是否能抑制尖孢镰刀菌的生长。 sp。莴苣 J. C. Hubb。 &格里克。我们接种了 F. oxysporum f。 sp。 conglutinans (Wollenweber) Snyder et Hansen 菌株 Cong:11 和 F. oxysporum f. sp。莴苣 J. C. Hubb。 & 格力克进入人工培养基中，每个播种有拟南芥（L.）Heynh。和 Lactuca sativa L. var。人头辅以 MPM 培养微生物。 MPM 微生物抑制 F. oxysporum f. sp。莴苣 J. C. Hubb。 & Gerik 生长和预防植物病害。因此，接种 MPM 的非土壤载体可以从有机物质中产生无机养分，也可以在没有天然土壤的情况下抑制疾病。我们的研究表明，使用 MPM 培养液中的微生物群落在非土壤培养基中产生了一种新的疾病抑制作用。60 多年来，人们已经认识到病害抑制土壤1.解释疾病抑制机制的假设是基于土壤矿物质、拮抗微生物和微生物生态系统的差异，但实际机制尚不清楚1.以前通过接种抑制或胜过病原体的拮抗微生物来产生疾病抑制土壤的尝试是无效的，因为微生物无法在土壤中建立5.要建立这些拮抗微生物，需要重建或模拟天然土壤微生物生态系统，但天然土壤将有机物降解为无机养分的能力尚未人为再现。由于无机肥料引起的富营养化及其高成本等问题，以及应该在农业中回收而不是丢弃的有机废物的日益可用性，实现这一能力将是一个重要的突破。在土壤中，有机氮的降解分两个步骤进行：氨化和硝化. 氮循环细菌（产生硝酸盐）因暴露于高浓度有机物而失活6.当这些细菌被灭活时，有机物的降解只在产生氨之前进行，这是有问题的，因为许多植物更喜欢硝酸盐，这会导致生长不良。筱原等人。 (2011) 开发了一种在非土壤介质中有效产生硝酸盐的新方法，例如在水培系统中使用的水中。总之，该方法包括三个步骤： (1) 将 10 g/L 的土壤加入1 国家农业和食品研究组织 (NARO) 蔬菜和花卉科学研究所，360 Ano, Tsu, Mie 514-2392, 日本。 2京都大学农业研究生院应用生命科学系，京都，日本。 3京都大学生理化学研究室，日本京都。 4 庆应义塾大学生物科学与信息学系，日本横滨。 5 富山县立大学生物技术研究中心和生物技术系，Imizu，日本。电子邮件：shsh@affrc.go.jp 科学报告|(2022) 12:7968 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-10667-12水作为微生物菌剂的来源，（2）添加少量有机肥，（3）给溶液充气。由此产生的系统可以通过同时进行氨化和硝化作用将有机物降解为无机营养物，例如硝酸盐。我们称之为“多重平行矿化”（MPM）方法。无固体培养基的水培条件，MPM溶液培养抑制了青枯病和枯萎病等根部疾病2.将MPM培养液接种到非土壤载体中，载体获得了天然土壤将有机物降解为无机养分的能力8.这种非土壤培养基也可能抑制病原微生物如镰刀菌的生长9.为了测试这种可能性，我们检查了将 MPM 微生物固定在非土壤固体载体上是否可以达到与抑制疾病的土壤相同的效果。 （这里，固定意味着微生物保留在载体内，而不是在溶液更新时通过浸出而丢失）。拟南芥 (L.) Heynh。和 Lactuca sativa L. var。 capitata 是尖孢镰刀菌的好宿主。 sp。 conglutinans (Wollenweber) Snyder et Hansen 菌株 Cong:11 和 F. oxysporum f. sp。莴苣 J. C. Hubb。 & 格力克7.据我们所知，这是第一项使用 MPM 系统成功开发可重复的疾病抑制生态系统的研究。材料和方法MPM 溶液制备。我们准备了 MPM 解决方案7 如下：我们将 1 g 苗圃土壤（Nae-ichiban；Sumirin Agro-Products，Aichi，Japan）和 1 g/L 鱼基可溶性肥料（Yaizu Susankagaku Industry，Yaizu，Japan）添加到 100 mL 蒸馏水中一个烧瓶，然后在摇动（120 rpm）的培养箱（CN-25C；Mitsubishi Electric，Tokyo，Japan）中在 25°C 的黑暗中将烧瓶培养 2 周。我们每天使用 Reflectoquant 测试条（Merck，Darmstadt，Germany）测量铵（目录号 116892）、亚硝酸盐（号 116973）和硝酸盐（号 116971）的无机 N 浓度6.我们根据每个试剂盒的制造商说明添加和混合提供的试剂，浸没试纸，并使用反射光度计（RQ-flex plus；默克，法兰克福，德国）测量显色程度。然后我们使用 MPM 溶液作为微生物菌剂。MPM微生物在岩棉上的固定化。我们将 10 μL MPM 溶液和 1 mL 1 g/L Yaizu 鱼基可溶性肥料加入 1 cm3Growcube 岩棉立方体（Grodan，Roemond，荷兰）并在 25 °C 下在黑暗中孵育立方体 24 小时。为了研究过量有机物对无机氮产生的影响，我们每 1 cm 添加 1 mL 1 g/L 用蒸馏水稀释的鱼肥3岩棉立方体每日。在黑暗中孵育过夜后，每个立方体用 1 mL 无菌水冲洗，然后在硝酸盐测量后，我们重复添加鱼肥并每天用无菌水冲洗 2 周。每天测量渗滤液中的无机氮、铵、亚硝酸盐和硝酸盐含量。我们使用这种方法进行了三个独立的实验，每个实验都有一个重复。病原体和培养条件。我们培养了植物病原真菌 Fusarium oxysporum f。 sp。 conglutinans (Wollenweber) Snyder et Hansen 菌株 Cong:117和 F. oxysporum f. sp。莴苣 J. C. Hubb。 & Gerik 菌株 H1113在含有 39 g/L 马铃薯葡萄糖琼脂 (Difco, Detroit, MI, USA) 的培养皿中，在 4 °C 下在黑暗中进行。然后，我们将 3 mm 直径的琼脂塞接种到烧瓶中的 100 mL 24 g/L 马铃薯葡萄糖肉汤 (Difco) 中，并在 25 °C 的轨道摇床 (120 rpm) 上在黑暗中培养溶液 5 天。我们通过两层无菌 Prowipe（195 mm × 125 mm；Elleair，Tokyo，Japan）过滤培养物，以消除细长的菌丝，但保留我们收集的小分生孢子。我们将滤液以 4000×g 离心 10 分钟并回收含有小分生孢子的沉淀物。然后，我们通过用 50 mL 无菌蒸馏水洗涤沉淀 3 次并重复离心来回收并重新悬浮小分生孢子。我们将微分生孢子悬浮液的最终浓度调整为 1×103在显微镜下计数细胞/mL。我们使用了 Komada 的选择性培养基（1.0 g/L Na2B4O7·10 H2O、1.0 g/L K2HPO4、0.5 g/L KCl、0.5 g/L MgSO4·7 H2O、0.01 g/L Fe-Na-EDTA、2.0 g/L L-天冬酰胺、20.0 g/L d-半乳糖、15.0 g/L琼脂、1.0 g/ L 五氯硝基苯、0.5 g/L 胆酸钠和 0.3 g/L 硫酸链霉素）作为尖孢镰刀菌的选择性培养基13.抑制多种载体上的病原体生长。研究 MPM 溶液中的微生物是否可以抑制尖孢镰刀菌的生长。 sp。莴苣 J. C. Hubb。 & Gerik，我们将 MPM 溶液 (10 μL) 和 1 mL 灭菌的烧津鱼基可溶性肥料 (1 g/L) 添加到 1-cm3灭菌岩棉块。我们用 MPM 溶液 (50 μL) 接种立方体并加入 5 mL 灭菌肥料 (1 g/L)，并使用另外两种非土壤介质重复接种：稻壳炭（约 5 cm3) 和蛭石 (约 5 cm3）。我们使用未接种的载体作为对照，将接种的培养基在 25°C 的黑暗中孵育 3 天。孵育后，我们按照“病原体和培养条件”提取小分生孢子，然后每 cm 加入 10 μL 小分生孢子悬液3 对三大媒体。最后，我们将培养基在 25°C 的黑暗中培养 7 天，每个重复 3 次。在此期间结束时，我们将载体样品（约 1 厘米3 岩棉和 5 厘米3 稻壳木炭和蛭石）在灭菌的研钵和研杵中，用 9 mL 灭菌水将岩棉样品稀释至原始浓度的 10%，其他介质用 5 mL 灭菌水稀释至原始浓度的 50%。我们通过在 Komada 的选择性培养基上连续接种来确定病原体密度。使用不同的肥料抑制病原体的生长。我们测试了 F. oxysporum f. 的抑制作用。 sp。莴苣 J. C. Hubb。 & Gerik 通过从 MPM 培养物中分离出的微生物与 Yaizu 鱼基可溶性肥料、玉米浆（Sigma-Aldrich, MO, USA）、营养肉汤（Bacto；Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France）、Bacto 进行生长蛋白胨、Bacto 胰蛋白胨和 Bacto 酵母提取物。我们接种了 科学报告|(2022) 12:7968 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-10667-13带有 MPM 溶液 (10 μL) 的载体，每 cm 加入 1 mL 灭菌肥料 (1 g/L)3灭菌的岩棉块，然后在 25°C 的黑暗中孵育 3 天，使用未接种的载体作为对照。孵育 3 天后，我们在培养基中接种 10 μL 每 cm 的小分生孢子悬浮液3.载体（1厘米3 石棉）然后用灭菌的研钵和研杵研磨，并用 9 mL 灭菌水稀释，以产生原始浓度 10% 的溶液。我们通过在 Komada 的选择性培养基上连续铺板来确定病原体密度。我们使用这种方法进行了三个独立的实验，每个实验都有一个重复。拟南芥 (L.) Heynh 的栽培。和 Lactuca sativa L. var。石棉立方体上的capita。我们使用拟南芥 (L.) Heynh。 (Col-0) (Funakoshi, Tokyo, Japan) 和 Lactuca sativa L. var.用于病原体接种试验。种子在通风的 WFO-600ND 烘箱（Eyela，Tokyo Rikakikai Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）中在 70°C 干热条件下灭菌 3 天，然后在 70% 乙醇中浸泡 20 分钟，然后在 5%次氯酸钠 20 分钟。然后将灭菌的种子在灭菌的蒸馏水中洗涤 3 次。我们使用无机肥料制备了 100 mL 无机营养液（Otsuka House No. 1 为 0.34 g/L，Otsuka House No. 2 为 0.23 g/L；Otsuka Chemical, Osaka, Japan）提供 60 mg/L 的硝酸盐-N，包装 100 厘米3 将岩棉立方体放入 9 厘米直径的多盆中（Tokai Kasei，Mino，Gifu，Japan）。然后我们用 1 mL 含有 60 mg/L 硝酸盐-N