脂多糖诱导的小鼠肺损伤导致长期肺部变化和血管生成途径的下调

科学报告|(2022) 12:10245| https://doi.org/10.1038/s41598-022-14618-81 打开脂多糖诱导小鼠肺损伤结果长期肺变化和血管生成通路的下调S. T. Tsikis1,2, S. C. Fligor1,2, T. I. Hirsch1,2, A. Pan1,2, L. J. Yu1,2, H. Kishikawa1,2, M. M. Joiner1,2,P. D. Mitchell3 & M. Puder1,2急性呼吸窘迫综合征是急性肺损伤 (ALI) 的最严重形式，并且与显着死亡率相关。脂多糖 (LPS) 诱导的损伤是一种有价值的 ALI 小鼠模型，但关于肺再生和血管生成信号传导涉及血管内皮生长因子 (VEGF) 的作用的数据很少。八周龄雄性 C57BL/6J 小鼠随机接受气管内滴注 LPS 或等容磷酸盐缓冲盐水作为载体对照。在短期（24 小时或 4 天）或长期（7 天或 4 周）的单个随访时间点观察小鼠。在肺功能测试中，LPS 治疗的小鼠在滴注 4 周后顺应性增加，这与血管化减少和肺泡化的时间依赖性进行性减少相关。跑步机运动耐量测试显示 LPS 暴露后 24 小时、4 天和 4 周的表现受损。在肺蛋白分析中，LPS 滴注在长达 4 周时降低了 VEGF 表达，并在滴注后 7 天和 4 周降低了其关键受体 VEGFR2 的活化。总之，这些数据提供了对 ALI 后 4 周长期肺功能结果的见解，并将血管生成蛋白确定为肺损伤后可能的治疗靶点。缩写阿里急性肺损伤ARDS急性呼吸窘迫综合征巴尔支气管肺泡灌洗液巴尔夫支气管肺泡灌洗液COL1A1I型胶原蛋白COL4A1IV型胶原蛋白乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸表皮生长因子受体表皮生长因子受体酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附测定 HPF 高功率场人力资源计划辣根过氧化物酶他苏木精和伊红IHC 免疫组织化学IL-6白细胞介素 6LPS脂多糖MAPK/ERK丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶 NRP-2 Neuropilin-2PBS磷酸盐缓冲溶液1哈佛医学院波士顿儿童医院血管生物学项目，波士顿，马萨诸塞州 02115，美国。 2哈佛医学院波士顿儿童医院外科，300 Longwood Ave, Fegan 3, Boston, MA 02115, USA。 3波士顿儿童医院临床和转化研究机构中心，波士顿，马萨诸塞州 02115，美国。电子邮件： Mark.Puder@childrens.harvard.edu 科学报告|(2022) 12:10245 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14618-82PBST含 0.05% Tween-20 PFT 的磷酸盐缓冲液肺功能测试聚偏氟乙烯聚二氟乙烯pEGFR磷酸化上皮生长因子受体pVEGFR2磷酸化血管内皮生长因子 2 RBC 红细胞里帕放射免疫沉淀法TBST含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水泰特跑步机运动耐量测试肿瘤坏死因子-a肿瘤坏死因子α血管内皮生长因子血管内皮生长因子急性肺损伤 (ALI) 和急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 的特征是出现双侧肺浸润伴肺泡损伤、透明膜形成和富含蛋白质的水肿，导致严重的低氧血症1.临床上，ARDS 与显着的发病率和死亡率相关，并且有多种原因，包括潜在的败血症、细菌/病毒性肺炎和外伤。据估计，在入住重症监护病房的患者中，高达 15% 的患者符合 ARDS 标准，其中 23% 的通气患者3.尽管重症监护取得了进展，但目前还没有针对 ALI 潜在病理生理学的有效药物，管理层仍然支持重点解决诱发原因1. 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 引起的 ARDS 的高发病率突显了迫切需要更好地了解 ALI 所涉及的潜在病理生理学4.脂多糖 (LPS) 诱导的肺损伤是最常用的 ALI 小鼠模型，在病理生理学上与人类 ARDS 有相似之处6.虽然 LPS 诱导的小鼠 ALI 的急性影响已得到充分表征，但关于孤立 LPS 暴露和肺恢复的长期肺影响的数据很少。在一项关于孤立雾化 LPS 暴露的研究中，在 5 周时观察到持续的肺部炎症和重塑7.在小鼠模型中研究 ALI 的长期影响可以提高对 ARDS/ALI 康复后人类持续症状的理解。观察性研究表明，超过三分之一的 COVID-19 患者出现持续的长期症状，并且患者在急性感染消退后肺功能受损8.通过血管重塑和血管生成的肺再生可能参与 ALI/ARDS 的恢复11.例如，一些数据表明，肺恢复的特征可能是血管生成信号的失调，包括血管内皮生长因子 (VEGF) 信号通路13.对这些途径的更好理解可能会揭示新的治疗靶点，这些靶点可以改善 ALI/ARDS 后的肺功能。在这项研究中，我们检查了 LPS 诱导的小鼠肺损伤后短期（24 小时至 7 天）和长期（4 周）肺恢复的指标。指标包括肺功能测试 (PFT)、跑步机运动耐量测试 (TETT)、肺形态测量和炎症标志物。还评估了血管生成信号和血管形成的长期变化。我们假设暴露于 LPS 的小鼠会表现出长期持续存在的肺功能下降，并且促血管生成信号通路会受到影响。结果LPS 治疗小鼠的体重在短期内显着下降。与对照组相比，LPS 治疗的动物在 24 小时（- 10.3% 对 - 4.2%，P < 0.0001）、4 天（- 14.1% 对 0.9%，P < 0.0001）和 7 天（- 6.2% 对 - 0.8%，P = 0.0009）后 LPS 滴注（补充图 1A-C）。两组在 4 周时体重增加，两组之间的体重增加没有显着差异（8.7% 对 6.9%，P = 0.28；补充图 1D）。 LPS 小鼠在 24 小时和 4 天出现炎症的临床症状，包括活动减少和毛皮皱褶，这在暴露后 7 天和 4 周时不明显（数据未显示）。没有动物因 LPS 给药而死亡。LPS 诱导的肺损伤会导致肺功能测试的长期变化。不同组的小鼠在安乐死的不同时间点进行 PFT 测量（图 1）。与对照小鼠相比，LPS 处理的小鼠在 24 小时时具有相似的顺应性（33.8 vs. 34.1 μL/cmH2O,P = 0.88）、4 天（31.3 对 35.9 μL/cmH2O，P = 0.27）和 7 天（36.5 对 35.3 μL/cmH2O，P = 0.73）后滴注（图 1A）。在 4 周时，与对照组相比，LPS 组的肺顺应性显着增加（44.9 对 40.1 μL/cmH2O，P = 0.03）。在不同的时间点肺阻力没有差异（图1B）。 4周时顺应性的增加也与通过组织弹性（图1C）和整体弹性（图1D）测量的肺弹性回缩降低相关。具体而言，LPS 处理小鼠 4 周时的组织弹性为 21.4 cmH2O*s/mL，而对照组为 25.4 cmH2O*s/mL (P = 0.01)。 LPS 组在 4 周时的弹性也较低（22.3 vs. 25.1 mL/cmH2O，P = 0.03）。在其余时间点，两种弹性反冲测量没有差异（图 1C，D）。LPS 给药产生炎症标志物的急性升高。分析支气管肺泡液 (BALF) 中的白细胞和急性炎症标志物。与对照组相比，LPS 处理的小鼠在 24 小时时 TNF-α（图 2A）和 IL-6（图 2B）均显着升高。在第 4 天、第 7 天和第 4 周时，对照小鼠和 LPS 治疗小鼠的两种标记物相似。在所有四个时间点，对照小鼠中 TNF-α 或 IL-6 的浓度没有显着差异（分别为 P = 0.48 和 P = 0.42）。 科学报告|(2022) 12:10245 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14618-83图1。肺功能检查。在滴注后 24 小时、4 天和 7 天，脂多糖 (LPS) 处理的小鼠与对照小鼠的肺顺应性相似，但在 4 周时间点顺应性显着增加。一个）.肺阻力无统计学差异(乙)在不同点的两组之间。组织弹性（C）, 和肺弹性(四), 措施在 4 周时，与对照组相比，LPS 治疗的小鼠的肺弹性回缩力也显着降低。根据小鼠体重调整顺应性。用学生 t 检验对每个时间点的实验组进行统计分析。由于实验是终端，每个时间点都由一个单独的群组表示。结果表示为平均值±SE。 *P < 0.05。从 LPS 处理的小鼠的 BALF 中分离的细胞放大 200 倍的代表性载玻片显示在滴注后 4 天主要由中性粒细胞组成的炎症浸润（图 2C），在 4 周时不存在（图 2D）。在第 4 天和第 4 周时，对照组中各种细胞的绝对计数没有观察到显着差异（补充图 2A、B）。中性粒细胞显着升高，并在 4 天时占 LPS 处理小鼠 BALF 中 72.1% 的细胞（补充图 2A，C），在 4 周时仅占 0.3% 的细胞（补充图 2B，C）。在 4 周时，单核细胞是对照 (72.1%) 和 LPS (52.0%) 小鼠的主要细胞类型。平均而言，LPS 处理的小鼠在 4 周时淋巴细胞百分比高于对照小鼠（补充图 2D），但这没有统计学意义（47.7% 对 27.1%，P = 0.55）。LPS 诱导的 ALI 在长期内会导致肺泡化逐渐减少。用 H&E 染色的福尔马林固定石蜡包埋肺在 400 倍放大率下进行检查。在滴注后 24 小时，LPS 治疗小鼠的肺泡数量与对照组相比没有统计学差异（图 3A；68.6 对 74.1 肺泡/hpf，P = 0.09）。 LPS 治疗小鼠的平均肺泡数量在 7 天时较低（图 3B；61.6 对 74.3 肺泡/hpf，P = 0.03），在 4 周时甚至更低（图 3C；50.5 对 68.5 肺泡/hpf）。 hpf，P = 0.02）。总体而言，三个时间点的肺泡逐渐减少（图 3D；P = 0.02）。在 400 倍放大倍率下获得的代表性显微照片显示 LPS 处理的小鼠从 24 小时（图 3E）到 7 天（图 3F）到滴注后 4 周（图 3G），肺泡逐渐简化。与对照组相比，LPS 处理的小鼠在 24 小时的肺泡体积（图 3I）更高（21.4 对 19.4 μL/g，P = 0.03）。同样，LPS 小鼠的隔膜表面积（图 3J）在 24 小时也增加（34.2 对 27.0 cm2/g，P = 0.00572）。在滴注后 7 天和 4 周，肺泡体积或隔膜表面积没有显着差异。此外，在三个时间点中的任何一个时间点均未观察到平均间隔厚度的显着差异（图 3K）。LPS 给药导致长期血管化减少。进行免疫组织化学 (IHC) 以描述观察到的机械和形态学变化的组织学基础。 LPS 处理的小鼠和对照组在 24 小时 (18.1% vs. 15.1%, P = 0.76)、7 天 (7.4% vs.5.6%, P = 0.25) 时 II 型肺细胞的比例没有显着差异，和 4 周（17.1% 对 10.8%，P = 0.33）。如前所述，使用 CD31 内皮细胞标记物（图 4）评估血管化14.在 24 小时和 7 天，LPS 处理的小鼠和对照之间的 CD31 染色没有显着差异。然而，在 4 周时，LPS 处理的小鼠与对照相比，CD31 染色显着减少（图 4B；0.15 对 0.24 抗体/染色细胞核，P = 0.02）。 科学报告|(2022) 12:10245 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14618-84图 2。支气管肺泡液 (BALF) 分析。包括肿瘤坏死因子 (TNF)-a 在内的急性炎症标志物（一个）和白细胞介素 (IL)-6(乙)与对照组相比，在滴注后 24 小时，脂多糖 (LPS) 处理的小鼠的 BALF 中的 BALF 升高。 4天、7天和4周TNF-α和IL-6水平无显着差异。 LPS 处理小鼠的 BALF 细胞放大 200 倍的代表性载玻片显示，在 4 天时间点主要由嗜中性粒细胞组成的炎症浸润。C)，它在 4 周时不存在 (D）。每个结果都以生物学和技术重复进行。用学生 t