四个 COVID-19 波中儿童 SARS-CoV-2 变异体的流行病学特征及其与临床表现的相关性

科学报告|(2022) 12:10194| https://doi.org/10.1038/s41598-022-14426-01 打开流行病学特征四次 COVID-19 浪潮中儿童 SARS-CoV-2 变体的数量以及与临床表现的相关性Claudia Alteri1,2, Rossana Scutari1,2,6, Valentino Costabile1,6, Luna Colagrossi1,3,Katia Yu La Rosa1,3, Emanuele Agliini5, Valentina Lanari5, Sara Chiurchiù4, Lorenza Romani4, Anna Hermine Markowich4, Paola Bernaschi3, Cristina Russo3, Antonio Novelli5,Stefania Bernardi4、Andrea Campana4、Alberto Villani4 和 Carlo Federico Perno1,3自 SARS-CoV-2 大流行开始以来，就 SARS-CoV-2 感染的频率和严重程度而言，一直将 12 岁以下的儿童定义为代表性不足。通过将 SARS-CoV-2 传播动力学与 612 名 12 岁以下 SARS-CoV-2 阳性患者的临床和病毒学特征相关联，我们证明了不同 SARS-CoV-2 谱系在儿科人群中的四次大流行浪潮，由当地传播链维持。年龄 < 5 岁、最高病毒载量、γ 和 δ 进化枝对这种局部传播产生积极影响。除了 B.1.1.7 与住院之间存在负相关外，未发现 COVID-19 表现与谱系或传播链之间存在相关性。自 2019 年冠状病毒病大流行 (COVID-19) 开始以来，对 SARS-CoV-2 传播动态进行持续监测和快速评估的重要性显而易见，以迅速意识到传播能力增加、毒力增加或临床疾病表现的变化，以及特定变体的公共卫生和社会措施的有效性降低1.旨在确定这些方面的所有研究均基于 SARS-CoV-2 感染人群，在大流行开始时，主要由成人和老年人群组成（由于仅适用于临床上先进的人群），风险较高严重的 COVID-19 表现2.截至 2021 年 12 月，尚无研究表征 SARS-CoV-2 变异体在四次大流行期间在新生儿和儿童中的传播情况。因此，关于儿童 SARS-CoV-2 传播轨迹、不同 SARS-CoV-2 变体如何影响不同年龄和/或可能改变疾病传播或模式的信息不足。儿童和青少年通常会出现不太严重的 COVID-19 表现4.大多数暴露于 SARS-CoV-2 的儿童仍然无症状或出现轻微的上呼吸道症状，这些症状会在几天内消退6.住院和严重长期表现的报告比成年人少，但不可忽视。多个独立团体确实在 SARS-CoV-2 检测呈阳性的年轻人中报告了严重和多种 COVID-19 相关疾病6.多系统炎症综合征（MIS-C）和心肌炎是长期与 COVID-19 相关的表现，主要与年轻有关8.就全球 SARS-CoV-2 患病率而言，儿童相对于成年人的代表性不足11.事实上，根据年龄，全球儿童 SARS-CoV-2 包括 1.8% 的 5 岁以下人口到 6.3% 的 5 至 14 岁人口11.最近，据报道，所有年龄组的 SARS-CoV-2 关注变体 (VOC) 的传播率都有所提高，尤其是 Delta 变体12.1 多模式研究区，Bambino Gesù 儿童医院 IRCCS，意大利罗马。 2 意大利米兰大学肿瘤学和血液肿瘤学系。 3 免疫学部门的微生物学和诊断，Bambino Gesù 儿童医院 IRCCS，罗马，意大利。 4 意大利罗马 IRCCS Bambino Gesù 儿童医院儿科学术部。 5医学遗传学实验室，转化细胞基因组学研究单位，Bambino Gesù 儿童医院 IRCCS，意大利罗马。 6这些作者的贡献相同：Rossana Scutari 和 Valentino Costabile。电子邮件：carlofederico.perno@opbg.net 科学报告|(2022) 12:10194 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14426-02然而，由于与 COVID-19 相关的症状不明显，不能排除在大流行的最初几个月，当诊断主要基于症状时，很大一部分 SARS-CoV-2 阳性儿童逃脱了 SARS -CoV-2筛查策略14，从而导致该人群中对 SARS-CoV-2 的低估。在这里，我们的目标是填补对 SARS-CoV-2 儿科流行病知识的空白，这要归功于大型科学儿科研究所 600 多名被诊断为 SARS-CoV-2 感染的儿童的病毒定义、传播动力学和临床特征用于意大利中部的研究、住院和医疗保健。本研究采用包含流行病学、临床和病毒遗传数据的综合方法，提供了一个独特的数据集，以更好地了解儿童 SARS-CoV-2 的时间演变，并确定出现的 SARS-CoV-2 变体临床表现的任何变化。方法样本收集和研究设计。这项回顾性观察研究最初包括 731 份 SARS-CoV-2 阳性鼻咽拭子，取自 2020 年 3 月 5 日至 8 月 31 日期间转诊至 Bambino Gesù 儿童医院 IRCCS (OPBG) 的 12 岁以下 COVID-19 患者, 2021。根据补充图 1 中定义的标准选择 SARS-CoV-2 阳性鼻咽拭子。最终仅选择了 612 个样本，原因是成功测序。通过化名的电子病历回顾性地获得人口统计学、流行病学和临床数据。研究方案经 OPBG 当地研究伦理委员会批准（prot. 2384_OPBG_2021）。这项研究是根据 1964 年赫尔辛基宣言的原则进行的。根据医院关于观察性回顾性研究的规定，放弃知情同意。 SARS-CoV-2 感染的严重程度是根据 Dong Y 等人在儿科中定义的。 202015，并基于我们队列中的临床特征、实验室测试和胸片成像。使用了以下定义： (i) 无症状感染定义为儿童在接触者追踪后检测出 SARS-CoV-2 阳性但未出现任何临床症状； (ii) 轻度感染定义为上呼吸道感染症状，例如咳嗽、喉咙痛、流鼻涕和打喷嚏，还可能包括发烧、疲劳、肌痛和/或胃肠道感染症状，定义为呕吐，腹痛、恶心或腹泻；(iii) 中度/重度感染定义为下呼吸道感染的症状，包括支气管炎或肺炎的临床症状（发烧、咳嗽、呼吸困难、呼吸急促），有或没有胃肠道症状的迹象。出现呼吸困难和氧饱和度< 92% 的患者被包括在这一类别中。在诊断时，通过针对三个不同 RNA 聚合酶 RNA 依赖 (RdRp) 区域的 ddPCR 自制方案对 SARS-CoV-2 RNA 进行量化16.然后将定量结果标准化为每毫升的拷贝数。病毒扩增和测序。使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit（公司名称、地点、国家）从鼻咽拭子中提取病毒 RNA，然后用 Agencourt RNA-Clean XP 珠子（公司名称、地点、国家）进行纯化。使用 Nanodrop 测量和检查所有分离的 RNA 样品的浓度和质量。 SARS-CoV-2 的全基因组序列的扩增子是使用 50 ng 病毒 RNA 模板，通过使用多重方法（例如CleanPlex SARS-CoV-2 Research and Surveillance Panel 和 QIAseq DIRECT SARS-CoV-2 Kit（公司名称、地点、国家/地区）17根据制造商的协议。然后使用带有 Illumina 索引适配器的 Nextera DNA Flex 文库制备试剂盒生成文库，并在 MiSeq 仪器（Illumina，San Diego，CA，USA）上以 2 × 150-bp 双末端读数进行测序。原始数据的基于参考的组装是根据19.使用 GitHub 免费分发的软件 vcf_consensus_builder 生成了 612 个共识序列20.保留所有具有 40% 的最小支持读取频率且深度 ≥ 10 的 SNP。系统发育分析。根据 PANGOLIN 应用程序 (Pangolin https://pangolin.cog-uk.io/) 分配获得的 612 个 SARS-CoV-2 共有序列的 SARS-CoV-2 谱系21.为了描述儿科序列与 SARS-CoV-2 多样性的相关性，根据位置和采样日期从 GISAID（GISAID 序列）中选择了 1233 个序列，其中 410 个 SARS-CoV-2 序列（本地序列）属于青少年和添加了居住在研究儿童人口同一区域的成人人口（> 12 岁）。使用 ClustalX 比对序列并使用 Bioedit 手动检查。最终比对有 2255 个序列，长度为 28,655 个核苷酸。通过组合方法确定显示显着同质性的比对位置，以说明可能是超变性或测序伪影结果的区域。首先使用 HomoplasyFinder 识别同质，然后通过 Treetime 确认（同质设置）22.为了探索影响年龄≤12岁人群的流行病的系统发育结构，最大似然（ML）24系统发育树首先使用由 GISAID、本地人群和儿科序列组成的完全比对进行。使用 IqTree 构建 ML 系统发育树24使用核苷酸替代 GTR I γ 的最佳拟合模型25.使用具有 1000 次重复的快速引导功能评估树拓扑。在 TempEst 中检查了 ML 树，26 为了定义遗传多样性（根到尖端的分歧）和样本收集时间之间的相关性（补充图2）。 SARS-CoV-2 序列的局部簇由遗传内距离 < 0.0002 和自举支持率 ≥ 99.0% 定义。贝叶斯合并方法27进一步进行，以确定儿童流行病随时间变化的系统发育结构，并确认潜在的传播链和集群。使用 BEAST v1.10.5 进行了第一次贝叶斯合并树分析27, 使用 GTR I γ25替换模型 科学报告|(2022) 12:10194 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14426-03在非信息性连续时间马尔可夫链 (CTMC) 参考先验下的指数种群增长树先验和严格的分子钟28仅使用儿科序列。在第一个贝叶斯树和 ML 树中确定的病毒传播和聚类信息最丰富的序列被合并到第二个贝叶斯树干扰中，以产生更稳健的传播簇重建（由后验概率支持 = 1 定义）。为 5000 万个状态运行了四个独立的链，每 1000 个状态对参数和树进行采样。完成后，在去除 10% 的状态作为老化后，使用 LogCombiner 组合链，并使用 Tracer (ESS > 100) 评估收敛。分类群集被定义并用于估计单系的后验概率和观察到的系统发育簇的 tMRCA 的后验分布。iTOL29用于使用有关谱系、集群、症状、住院和 SARS-CoV-2 病毒载量的信息来注释系统发育树。统计分析。似然比检验，然后是多项逻辑回归模型来估计优势比的 95% 置信区间，用于比较一般和选定的 SARS-CoV-2 感染人群之间的人口统计学和临床发现。Kruskal-Wallis 和趋势卡方检验用于估计不同谱系和传播集群之间的显着变化。 Mann-Whitney 检验和 Fisher 精确检验用于估计簇内序列和簇外序列之间的显着变化。进行多变量逻辑回归分析以评估与聚类和住院独立相关的人口统计学、病毒相关和临床因素。总是报告两侧 p 值。使用 Rgui 和统计软件包 SPSS (v32.0; SPSS Inc., Chicago, IL) 分析数据。结果患者的特征。从 2020 年 3 月 5 日到 2021 年 8 月 31 日，在罗马主要儿科医院对 45,573 名 12 岁以下个体的鼻咽拭子进行了 SARS-CoV-2 感染筛查（补充图 1）。其中 2399 人被确诊为 COVID-19，2020 年 3 月至 7 月期间的阳性率为 0.6%，2020 年 8 月至 2020 年 12 月期间为 5.2%，20