WHO BS 2023.2459 关于建立第二个 WHO SARS - CoV - 2 RNA 国际标准的合作研究

WHO/BS/2023.2459 仅限英语 生物标准化专家委员会 日内瓦，2023年10月16日至19日 建立WHO第二次SARS-CoV-2RNA国际标准的合作研究 EmmaM.Bentley1＃，YannLeDuff2，ClaireHam3，CatherineCherry1，GiadaMattiuzzo2，JaquelineFryer4，ClareMorris5，JasonHockley6，NeilAlmond3，PaulStickings1，PeterRigsby6和协作研究组* 1疫苗参考材料，2病毒疫苗，3诊断，4治疗参考材料，5市场分析，制造和物流和6生物统计学组， 英国药品和保健品监管机构#研究协调员，电子邮件：emma.bentley@mhra.gov.uk *列于附录1 注: 本文件是为了征求对其中包含的建议的意见和建议，然后由生物标准化专家委员会(ECBS)审议。 2023年10月2日并应致函世界卫生组织，瑞士日内瓦1211，注意：技术，标准和规范（TSS ）。评论也可以电子方式提交给负责官员：IvanaKnezevic博士电子邮件:knezevici@who.int. ©世界卫生组织2023 保留所有权利。世界卫生组织的出版物可在世卫组织网站（www.who.int）上获得，也可以从世界卫生组织出版社购买，地址：瑞士日内瓦1211阿皮亚大道20号（电话：4122791） 3264；传真：+41227914857；电子邮件：bookorders@who.int)。 复制或翻译世卫组织出版物——无论是出售还是非商业发行——的许可请求应通过世卫组织网站向世卫组织出版社提出:(http://www.who.int/about/licensing/copyright_form/en/index.html)。 本出版物中使用的名称和材料的呈现并不意味着世界卫生组织对任何国家、领土、城市或地区或其 地图上的虚线代表可能尚未完全同意的近似边界线。 提及特定公司或某些制造商的产品并不意味着它们得到世界卫生组织的认可或推荐，而不是未提及的其他类似性质的产品。除错误和遗漏外 ，专有产品的名称以首字母大写字母区分。 世界卫生组织已采取所有合理的预防措施来验证本出版物中包含的信息。然而，发布的材料是在没有任何明示或暗示保证的情况下分发的。解释和使用材料的责任在于读者。在任何情况下，世界卫生组织都不对因其使用而造成的损害负责。仅指定作者负责本出版物中表达的观点。 Summary WHOECBS于2020年12月建立了首个SARS-CoV-2RNA（20/146）的WHO国际标准（IS） ，以加快时间框架，以支持开发基于诊断核酸扩增技术（NAT）的检测方法来应对COVID-19大流行。鉴于市场上有大量基于NAT的商业平台，对FirstIS的需求很高，库存接近枯竭。当前的监管格局和诊断感染的持续全球公共卫生重要性意味着对IS的需求将继续，并且需要在单位和可用性方面提供连续性。本报告描述了一项多中心合作研究的结果，以评估第二个WHOIS对SARS-CoV-2RNA（22/252）的候选物的适用性，并提出了国际单位分配。候选的SecodWHOIS已准备好成为同类替代品，包括SARS-CoV-2的灭活的关注前变体（VOC）分离株。与第一个WHOIS和代表五个VOC的一组样品一起评估了性能。22个实验室参与了这项研究，从34种方法中返回了47个数据集，其中22个基于商业平台。所使用的方法包括实时PCR、数字PCR、TMA、LAMP和qSTAR技术。相对于标准表达数据时，对实验室间变异性降低的评估表明，能够在分子技术范围内进行协调，而VOC之间没有明显差异。发现第一个和第二个候选WHOIS具有相似的表现。 研究表明，相对于标准报告，定性和定量方法报告的数据之间的一致性得到了改善，只有0.01对数10IU/mL的平均效价差异为候选的第二个WHOIS相对于第一个WHOIS。因此，建议将22/252确立为用于NAT测定的SARS-CoV-2RNA的第二个WHO国际标准，指定效价为7.50Log10基于组合方法的IU/安瓿平均效力。 Introduction 自2019年12月报告首例严重急性呼吸道综合症冠状病毒-2（SARS-CoV-2）病例以及2020年1月世卫组织宣布国际关注的突发公共卫生事件（PHEIC）和2020年3月全球COVID-19大流行以来，分子诊断检测的需求和实施是前所未有的。这最初是由早期获得的完整基因组序列的病毒[1]和世界卫生组织出版的内部PCR检测方案[2]迅速促进全球诊断检测能力的核酸扩增技术（NAT）。为了支持这些努力，WHOECBS于2020年12月建立了SARS-CoV-2RNA（20/146）的第一个WHO国际标准（IS），并在加速的时间表下制定。 通过校准到国际单位（IU）的分子诊断的标准化提供了一种重要的手段，通过该手段可以比较和控制用于检测SRAS-CoV-2RNA的平台。向IU报告的数据的协调使得可以更好地定义参数,例如分析灵敏度/检测限。在其成立之时，已经有超过350种基于NAT的产品投放市场，目前的数量仍然存在 。 在>700[4]，因此对第一个世卫组织IS的需求很高，在编写本报告时，有1,800多个小瓶分发给全球400多个最终用户/公司，库存接近枯竭。 COVID-19诊断前景仍然非常活跃，在可预见的未来，对WHOIS的需求可能会继续。随着世界卫生组织于2023年5月5日宣布PHEIC[5]结束，这启动了从紧急使用许可到传统资格预审评估途径的过渡期[6]。在全球范围内，监管机构可能会进入过渡期或调整COVID-19分子设备立法。确认COVID-19的临床诊断将通过基于NAT的方法检测SARS-CoV-2特异性RNA来保持。此外，将继续积极监测和评估关注的循环变体（VOC）。因此，将需要IS的单位和可用性的连续性，并及时过渡到第二个WHOIS，以支持对新平台和更新平台的持续评估和监管审查。2022年10月，WHOECBS批准了替换SARS-CoV-2RNA的第一个WHOIS的提议。 本报告描述了准备和多中心合作研究，以评估用于NAT测定的SARS-CoV-2RNA的第二个WHOIS。与第一个WHOIS一样，候选第二个IS基于灭活的前VOC（武汉样）分离株。尽管自2022年初以来，主要的循环变体已落入Omicro谱系下[7]，但保持IU连续性和循环菌株内遗传多样性水平的重要性，以及分子诊断检测所有序列的要求，并不支持过渡到更新的菌株。然而，自第一个WHOIS成立以来，这项研究需要适应分子景观的变化。这包括包括一组灭活的SARS-CoV-2VOC ，以证明变体之间的协调，以及招募比替代研究通常需要的更广泛的参与者（20-30），以捕获广泛的分子技术。 这项合作研究的目的是： 在不同实验室进行的一系列典型测定中，与第一个WHO国际标准平行评估候选物的效力/读数。 表征候选物在不同测定系统中的反应性/特异性。 评估可交换性,即确定候选物适合用作多种不同样品/菌株的标准的程度。 为第二份世卫组织国际标准提出一个单位，以确保国际单位使用的连续性。 材料和方法 候选标准 候选替代标准(NIBSC代码22/252)包括灭活的SARS-CoV-2(pre-VOC)分离物的冻干制剂。病毒块是使用BetaCoV/Astralia/VIC01/2020分离株（Geba登录号MT007544.1）制备的，该分离株由皇家墨尔本医院（澳大利亚）的维多利亚传染病参考实验室捐赠给MHRA。该病毒在第3代在MHRA处接受,并在Vero/hSLAM(ECACC#04091501)中以0.001的MOI再扩增一次传代,并在接种后72小时收获。病毒块的感染滴度测量为2.15X107TCID。50/mL通过Vero-E6细胞(ATCC®CRL -1586)上的终点滴定。使用衍生自Moore等人中描述的方法的方案进行下一代测序(NGS)。[8]确认繁殖批次病毒的遗传完整性。在使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒（Qiage＃52904）提取病毒RNA后，使用SperscriptIV第一链cDNA合成试剂盒（ThermoFisher＃18091050）产生cDNA，并使用Q5高保真2x主混合物（NEB＃M0492S）进行PCR。使用AMPreXP珠子(BecmaColter#A63880)纯化扩增子,并使用IllmiaDNANexteraFlex产生测序文库。在IllmiaMiSeq上对文库进行测序 ，并使用ivar和lofreq变体调用者作为内部开发的生物信息学管道的一部分，针对武汉-1参考序列 （Geba登录号NC_045512.2）调用变体。附录2提供了变化表。 使用经验证的酸热处理方案(在附录3中详细描述)进行病毒的灭活。简而言之,将病毒培养物用3%v/v乙酸孵育15分钟,并通过添加氢氧化钠中和,然后在60°C下孵育1小时。通过在3周的时间内在高度易感的Vero-E6/TMPRSS2细胞系(NIBSC#100978)中将10%的原液传代3次来验证病毒原液的失活,以及阳性和阴性对照。监测细胞的细胞病变征象。 EffectandculturemediatestedforanyquanitableincreaseinvirusRNAbyRT-qPCR.Novillingviruswasdetected.TheinactivationprocedurewasapprovedbytheMHRABiologicalSafetyCommittee. 为了配制大量的22/252以准备填充,使用Amico®Ultra50Da离心过滤柱纯化灭活的病毒培养物,并重悬于通用缓冲液(10mMTris-HCl(pH7.4)、0.5%人血清白蛋白和1%D-(+)-海藻糖脱水物)中。通过使用引物/探针靶向E基因的内部RT-qPCR，相对于第一个WHO国际标准20/146（1x107.7IU/mL）确定了库存中SARS-CoV-2基因组拷贝的定量[9]。将原液在通用缓冲液中以 1:100稀释,该缓冲液包括~1×105拷贝/mL的人基因组DNA(本文称为UB+)的背景,以得到2.8L的最终体积,效力为约。 ~1x107.8IU/mL。 候选人的灌装和冻干 22/252的填充和冻干由MHRA的制造团队在2022年11月24日至28日之间根据ISO9001进行。将 材料以0.5mL体积分配到2.5mL玻璃DIN安瓿中，在4°C在AVF5090灌装线上(Basch&Stroebel,Ilshofe,Germay)。通过在线检重一定比例的填充安瓿来保持填充的均匀性。用13mm直径的卤代丁基冰屋封闭物部分塞住填充的安瓿,并在CS100冷冻干燥器中冻干。在4°C下将安瓿装载到搁架上,并且在1.5小时内进行初次冷冻至-50°C。在-30°C下在30μb真空下进行初级干燥40小时,然后将搁板温度升高至25°C并在二次干燥中保持真空至少15小时,然后释放真空并用氮气回填小瓶。安瓿在相同的填充线上火焰密封。将密封的小瓶在-20°C下在连续温度监测下储存产品的寿命。 对于12个冻干产品小瓶,测定残留水分和氧含量的评估,作为冷冻干燥完成和密封后小瓶完整性的指标。 使用比色法KarlFischer（CA-200，三菱仪器，通过A1-EvirosciecesLtd，Blyth，UK）在干燥箱中操作，并在使用AqamicroChecP水标准（A1Eviroscieces）进行分析之前检查性能，以提供%w/w水分读数。使用FMS-760氧气顶空分析仪(LighthayIstrmets,Charlottesville,VA,USA)通过调频红外光谱法非侵入性地测量氧含量。 冻干候选物的稳定性 2023年1月开始对冻干候选标准22/252进行加速降解研究，以预测材料的稳定性。将15个安瓿