2021年中国基因编辑技术开发现状及应用前景探析

头豹研究院简介 u头豹是国内领先的原创行企研究内容平台和新型企业服务提供商。围绕“协助企业加速资本价值的挖掘、提升、传播”这一核心目标，头豹打造了一系列产品及解决方案，包括：数据库服务、行企研报服务、微估值及微尽调自动化产品、财务顾问服务、PR及IR服务，以及其他企业增长咨询服务等 u头豹致力于以优质商业资源共享为基础，利用大数据、区块链和人工智能等技术，围绕产业焦点、热点问题，基于丰富案例和海量数据，通过开放合作的研究平台，汇集各界智慧，推动产业健康、有序、可持续发展 2万+ 100万+ 5,000+ 300+ 50万+ 研报阅读渠道 详情咨询 摘要 TALENs和CRISPR/Cas9对比，虽然当下TALENs在临床上应用更广泛，但CRISPR/Cas9优势突出，其系统设计简便、可实现多基因编辑。由于CRISPR/Cas9问世时间较短，评估其临床应用风险需要时日，但未来CRISPR/Cas9切割元件的优化趋势下，以CRISPR/Cas9为代表的CRISPR技术或将主导基因编辑技术的未来。 基因编辑技术，腾飞在即的重磅科技 基因编辑技术主要包括三种。ZFNs是第一代基因编辑技术，优势为基因修复方式多样、精准更换基因、对基因表达强度影响较小，但已被Sangamo专利封锁而无法规模化应用。而TALENs结构类似于ZFNs，较ZFNs毒性低且构建容易，它成为Z F N s的替代物迅速出现 ， 是首个真正意义上的基因可编辑工具 。 在疾病防治和精准医疗等医学领域中，基因编辑技术当前主要被用于尚无有效治疗方法的、严重威胁生命的疾病。 同时，基因编辑技术有望为近6,000种尚无有效治疗方法的人类遗传疾病带来治疗方法，乃至治愈希望。 CRISPR/Cas9技术是2012年出现的最新的基因编辑技术，被Nature杂志列为2013年年度十大科技进展之一，其为轻量级的基因编辑系统，可对基因进行定点的精确编辑。 从CRISPR技术步骤演进技术标记点看，准确度（如脱靶、识别度低等）和适应性（如毒性、特异性和耐药性等）成为靶向基因治疗研究的关键问题，这些问题与CRISPR在医学、植物及工业的应用性密切相关。基因编辑技术也将更聚焦于技术的适应性及应用性。基因编辑技术研究者正在探索不同的酶、不同的蛋白序列和精确的修复方式等，以及寻找新的替代方式。同时也开始研发体细胞基因组编辑，直接治疗遗传疾病。 基因编辑价值链下游应用场景多元且丰富。基因编辑将带来巨大的社会价值与经济价值。以体外基因编辑疗法为例，其在癌症、SCD、HIV等适应症研究已步入临床，而对标单抗药物飞速发展的轨迹，预计未来基因编辑疗法将步入腾飞阶段。 名词解释TERMS upre-crRNA：Pre-CRISPR-derived RNA，在CRISPR基因编辑技术操作过程中目标衍生的RNA。 uTra-crRNA：Trans-activating RNA，在CRISPR基因编辑技术操作过程中反式激活的crRNA。 usgRNA：Small guide RNA，向导RNA，原核生物及植物线粒体中进行RNA编辑所需的RNA序列，是与正确编辑的RNA序列互补的一小段RNA，被用来作为向未经编辑的RNA中插入碱基的模板。 u靶细胞：能识别某种特定激素或神经递质并与之特异性结合而产生某种生物效应的细胞。 u锌指蛋白：含有通过结合Zn2+稳定的短的可以自我折叠形成“手指”结构的一类蛋白质。 uDNA限制性内切酶酶切：基于DNA限制性内切酶的基因工程技术，其基本原理是利用限制性内切酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。 uTAL效应子：Ttranscriptionactivator-like (TAL) effector nucleases，转录激活因子样效应物核酸酶效应子。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。 u核酸酶：在核酸分解的第一步中，作用于水解核苷酸之间的磷酸二酯键的一种核酸。在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的。 u同源重组：发生在非姐妹染色单体（sister chromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 u非同源末端连接：Non-homologous end joining，NHEJ，真核生物细胞在不依赖DNA同源性的情况下，而为了避免DNA或染色体断裂的滞留，避免因此造成的DNA降解或对生命力的影响，强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制。 u核糖核酸酶：只能水解RNA磷酸二酯键的酶称核糖核酸酶。 u双链断裂模组：染色体两条链发生断裂后由核酸外切酶扩大缺口，断裂链的游离3’端插入到具有完整双链的同源染色体中，形成D-环结构，在DNA聚合酶的作用下，断裂两条链分别以完整链为模板开始合成。解离酶交割Holliday交叉点，释放双链留下的缺口由DNA连接酶缝合。 uBp：Base Pair，碱基对，一对相互匹配的碱基（即A—T，G—C，A—U相互作用），由氢键连接。 u寡核苷酸：只有50个以下碱基的短链核苷酸的总称，包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸。 名词解释TERMS 即CAR-T细胞，利用CAR识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。 uT细胞：T淋巴细胞，是人体白细胞的一种，来源于骨髓造血干细胞，在胸腺中成熟，然后移居到人体血液、淋巴和周围组织器官，发挥免疫功能。内源性αβT细胞 u抗宿主反应：移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应，这种反应不仅导致移植失败，还可以给受者造成严重后果。 uTCR：T cell receptor，所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR—CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。 u靶向治疗：在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点的治疗方式，该位点可以是肿瘤细胞内部的某一蛋白分子或基因片段）。 uB细胞：B淋巴细胞，来源于骨髓的多能干细胞。 u脱靶效应：在靶向治疗中，未能达到预先设定的目标,有所偏移的现象。 uHNH结构域：Cas9蛋白的两种核酸酶模块之一，另一种为RuvC结构域。 uRuvC结构域：Cas9蛋白的两种核酸酶模块之一，另一种为HNH结构域。 u模式动物：生物学家通过对选定的动物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象的选定的生物物种。 u基因敲除：用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。 基因编辑技术开发现状 ZFNs是第一代基因编辑技术，优势为基因修复方式多样、精准更换基因、对基因表达强度影响较小，但已被Sangamo专利封锁而无法规模化应用 TALENs结构类似于ZFNs，较ZFNs毒性低且构建容易，它成为ZFNs的替代物迅速出现，是首个真正意义上的基因可编辑工具 CRISPR/Cas9技术是2012年出现的最新的基因编辑技术，被Nature杂志列为2013年年度十大科技进展之一，其为轻量级的基因编辑系统，可对基因进行定点的精确编辑 基因编辑技术开发现状——定义及分类 基因编辑的临床转化正在全球范围内高速推进，技术主要包括ZFN技术、TALEN技术、CRISPR/Cas技术及RNA编辑技术 基因编辑技术定义及分类 分类 细分类 意义 描述 qZFN技术 第一代基因编辑技术 q 基因编辑是指对目标基因进行删除、替换、插入等操作，以获得新的功能或表型。 q 基因编辑是生命医学领域的革命性技术，基因编辑技术的开发及应用使得生物体的遗传改造进入了前所未有的深度与广度，其临床转化也正在全球范围内高速推进。 qTALEN技术 第二代基因编辑技术 q 基因编辑技术主要包括ZFN技术、TALEN技术、CRISPR/Cas技术及RNA编辑技术。 第三代基因编辑技术（CRISPR/Cas9） qCRISPR/Cas技术及其衍生技术 q DNA编辑是对遗传信息永久的改变，因此DNA编辑必须既安全又有效地进行。相比之下，RNA碱基编辑是可逆的，且编辑效果与剂量有关。RNA编辑技术提供了修复突变的新方法，正逐渐成为基因编辑技术重要的组成部分。 qRNA编辑技术 可靶向编辑RNA（如LEAPER） 基因编辑技术开发现状——ZFNs ZFNs是第一代基因编辑技术，优势为基因修复方式多样、精准更换基因、对基因表达强度影响较小，但已被Sangamo专利封锁而无法规模化应用 ZFNs识别模式 ZFNs应用性与专利封锁 ZF1ZF2 ZF3 FokⅠ ZFN组合技术专利 5’ 5’ ZFN与FokⅠ连接专利 其他企业 Sangamo ZFNs破坏果蝇体内基因相关专利 ZFNs修复人类细胞中缺陷基因相关专利 3’ 3’ ZFN三维结构专利 FokⅠ ZF1ZF2 ZF3 q 锌指核酸酶技术（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）被称为第一代基因编辑技术。 q ZFNs优势为基因修复方式多样、精准更换基因、对基因表达强度影响较小。ZFNs劣势为设计与筛选过程复杂、“可编辑性”较低、存在脱靶风险和细胞毒性及治疗成本高。 q ZFN由锌指蛋白（Zinc Finger Protein，ZFP）和FokⅠ内切酶的核酸酶结构域组成，前者负责识别，后者负责切割DNA。ZFP是自然存在的蛋白结构，其由锌指结构（Zinc Finger，ZF）组成，ZF能识别特定的3个连续碱基对，因此可通过串联ZF的数量调整ZFN的识别特异性。FokⅠ通过N端与ZFP连接，由于FokⅠ以二聚体的形式发挥切割作用，ZFN使用时需要成对设计。 q 但是，ZFNs存在专利封锁。ZFN核心技术专利掌握在数位科学家手中，这些科学家陆续加入或专利授权给美国Sangamo。其获得了ZFN设计、筛选、优化、实验室和临床应用相关的数个关键专利，将其垄断。ZFNs的技术自问世至今无大规模应用，且无突破性进展。 q ZFN从1996年问世，在2001年开始被陆续用于不同物种的基因编辑。 基因编辑技术开发现状——TALENs TALENs结构类似于ZFNs，较ZFNs毒性低且构建容易，它成为ZFNs的替代物迅速出现，是首个真正意义上的基因可编辑工具 TALENs结构 TALENs识别模式与应用性 基因编辑技术开发现状——CRISPR/Cas9（1/2） CRISPR/Cas9技术是2012年出现的最新的基因编辑技术，被Nature杂志列为2013年年度十大科技进展之一，其为轻量级的基因编辑系统，可对基因进行定点的精确编辑 CRISPR/Cas9系统组件及功能 CRISPR/Cas9识别模式 Cas9 组件 功能 一端通过碱基配对结合目标DNA特定序列，另一端结合tracrRNA形成嵌合RNA crRNA q CRISPR/Cas系统原本是细菌和古菌进化出来用于抵御外来病毒及质粒DNA的适应性免疫系统。 sgRNA 3’ 5’ 5’ tracrRNA 与crRNA组成嵌合RNA 5’ q 根据核心蛋白元件以及用途的不同，目前CRISPR系统可分为2大类，其中研究最多、进展最快、应用最广的是第二大类中的II型（CRISPR/Cas9），其被Nature列为2013年年度十大科技进展之一。 3’ 3’ 由1个tracrRNA和至少1个crRNA组成 gRNA q II型CRISPR/Cas系统依赖于外源DNA片段在规律成簇的短间隔回文重复位点整合，其经过转录及剪切后产生短