使用宽场偏振二次谐波显微镜进行机器学习支持的癌症诊断

科学报告|(2022) 12:10290| https://doi.org/10.1038/s41598-022-13623-11 打开机器学习支持的癌症用宽场偏振二次谐波发生显微镜进行诊断Kamdin Mirsanaye1,2, Leonardo Uribe Castaño1,2, Yasmeen Kamaliddin1,2, Ahmad Golaraei1,2,3, Renaldas Augulis4, Lukas Kontenis5,6, Susan J. Done3,7,8,Edvardas Žurauskas9, Vuk Stambolic3,7, Brian C. Wilson3,7 & Virginijus Barzda1,2,5细胞外基质 (ECM) 胶原在肿瘤发生过程中经历了重大的重塑。然而，由于苏木精和伊红染色 (H&E) 组织切片的白光图像中胶原纤维的外观大多均匀，因此在癌症诊断中并未广泛考虑对 ECM 的改变。极化二次谐波 (P-SHG) 显微镜可实现非中心对称分子的无标记可视化和超微结构研究，当与纹理分析相结合时，可提供组织胶原蛋白的多参数表征。这个论文展示了使用高通量宽场 P-SHG 显微镜对乳腺组织微阵列进行全玻片成像。生成的 P-SHG 参数用于分类以区分肿瘤与正常组织，导致准确率和 F1 评分均为 94.2%，错误发现率为 6.3%。随后，使用经过训练的分类器以 91.3% 的准确率、90.7% 的 F1 评分和 13.8% 的错误遗漏率来预测肿瘤组织。因此，我们表明，广角 P-SHG 显微镜可揭示大组织区域的胶原超微结构，并可用作癌症诊断和预后研究的敏感生物标志物。癌症是导致死亡的主要原因之一，影响全球约五分之一的人；预计将增加的数字∼ 47% 到 2040 年1.最常见的癌症诊断技术依赖于用白光显微镜检查的苏木精和伊红 (H&E) 染色组织切片的金标准组织病理学2. H&E 组织病理学主要关注细胞核的特征和组织细胞排列。然而，背景富含胶原蛋白的细胞外基质 (ECM) 的超微结构和质地也可以作为额外的生物标志物。胶原蛋白是 ECM 的主要成分，在肿瘤发生过程中会发生结构改变3.几种污渍，包括 Movat 的五色4, 马松三色5, 天狼星红7，以及免疫组化标记6 已被用于突出胶原蛋白。然而，使用 ECM 胶原蛋白作为生物标志物并没有广泛用于癌症诊断，因为细微的结构变化可能很难用白光显微镜检测到。二次谐波 (SHG) 显微镜提供了一种替代成像方式，它能够以高特异性对胶原 ECM 进行无标记可视化8. SHG 信号取决于非中心对称胶原原纤维的固有 3D 结构，其特征在于非线性磁化率张量，以及入射激光偏振10.因此，偏振 SHG (P-SHG) 可用于激光扫描显微镜来测量组织的每个成像体素的非线性磁化率张量元素。它进一步用于识别肺癌中多种人类肿瘤类型的癌症相关 ECM 改变11， 甲状腺12， 胸部13, 胰腺16, 和卵巢17.然而，目前的 P-SHG 显微技术依赖于成像区域的光栅扫描，这对于整个载玻片成像和高通量临床应用来说速度很慢。1 多伦多大学物理系，加拿大多伦多。 2加拿大密西沙加多伦多大学化学和物理科学系。 3加拿大多伦多大学健康网络玛格丽特公主癌症中心。 4国家病理学中心，立陶宛维尔纽斯。 5 立陶宛维尔纽斯维尔纽斯大学物理学院激光研究中心。 6Light Conversion，立陶宛维尔纽斯。 7加拿大多伦多大学医学生物物理学系。 8多伦多大学检验医学和病理学系，加拿大多伦多。 9 立陶宛维尔纽斯维尔纽斯大学医学院病理学、法医学和药理学系。电子邮件：virgis.barzda@utoronto.ca 科学报告|(2022) 12:10290 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13623-12zzzzxx最近，与激光扫描系统相比，宽场 SHG 显微术显着减少了大面积成像所需的时间18.基于这项技术，我们通过将 P-SHG 与宽场显微镜相结合，开发了一种高通量定量成像技术。宽场 P-SHG 显微镜可以使用 16 种正交偏振态对大样本区域（几毫米）进行快速无扫描成像。此外，随后的图像处理避免了耗时的逐像素模型拟合，并提供了一系列突出胶原 ECM 超微结构特性的偏振参数。此外，可以使用极化参数的纹理分析来研究癌组织 ECM 中胶原纤维的形态组织19. P-SHG 偏振参数的纹理分析以前用于肺癌研究，揭示了有助于表征肿瘤组织的重要特征23.在这项工作中，来自宽场 P-SHG 成像的偏振和纹理参数被用于训练逻辑回归分类器，该分类器能够以 94.2% 的准确度和 F1 分数以及 6.3% 的错误发现率在人体中区分正常组织和肿瘤组织乳腺组织微阵列载玻片。然后通过在独立数据集上预测肿瘤的存在来进一步评估经过训练的分类器，产生 91.3% 的准确率、90.7% 的 F1 分数和 13.8% 的错误遗漏率。在图像后处理中实施机器学习增强了正常组织和肿瘤组织的区分，有可能实现自动筛选，例如，组织微阵列，以及改变胶原蛋白的映射区域，以改善组织病理学诊断。结果实验设计和概述。我们开发了一种用于快速高通量定量成像的宽场 P-SHG 显微技术，我们将其应用于乳腺组织微阵列。该方法生成一组信息丰富的偏振和纹理参数，并利用这些参数对正常和肿瘤组织进行分类。图 1 显示了实验工作流程的概述。组织微阵列载玻片在宽场 P-SHG 显微镜下成像，具有 16 种独特的输入和输出偏振态组合（图 1a）。如图 1b 所示（更多细节参见补充信息），根据减少的双 Stokes-Mueller 偏振法，将这些组合生成 SHG Stokes 矢量元素的图像。提取了以下 5 个不同的偏振参数的图像，并用于表征每个图像像素中胶原蛋白的超微结构：（1）所有入射圆偏振的平均 SHG 强度，（2）R 比，即 2 非手性秒的比值-阶非线性光学磁化率元素（χ2)2), 其中 z 轴平行到胶原纤维轴），（3）圆偏振度（DCP），（4）SHG圆二色性（SHG-CD），和(5) SHG线性二色性(SHG-LD)。每个极化参数都携带有关 ECM 胶原蛋白的独特超微结构信息。圆入射偏振获得的 SHG 强度对焦点体积中胶原的分子组织高度敏感，并且与胶原纤维的面内方向无关。相邻胶原原纤维的极性、原纤维在图像平面外的倾斜角、原纤维的交叉以及原纤维之间的距离影响 SHG 强度10.已经表明，在各种实体瘤中 SHG 强度降低26. R 比描述了焦点体积中胶原纤维的结构组织，它对纤维的超微结构、图像平面外的纤维倾斜角和纤维的交叉很敏感。 R 比已成功用于区分肺、乳腺、甲状腺和胰腺中的正常和恶性组织11. DCP的值与非散射组织中的R比密切相关，反映了样本中的无序和去极化28. SHG-CD 取决于 R 比、面外光纤倾斜角和极性，以及非手性和手性磁化率分量之间的相位延迟10. SHG-CD已被用于卵巢癌的研究25.在这里，我们介绍 SHG-LD 作为 P-SHG 显微镜中的一个新参数，以研究 ECM 中胶原纤维的平面内组织。最近的研究表明，由于 R 比和复杂的手性敏感性，从 SHG-LD 计算的胶原纤维取向略有改变24. SHG-LD 的类似定义以前用于对用非线性光学发色团官能化的手性聚合物的 Langmuir-Blodgett 薄膜的表面 SHG 测量32.在这项工作中，我们使用圆偏振光的 SHG 强度来评估组织中对齐的胶原纤维的存在。 R-Ratio 用于确定胶原纤维分子组成的细微变化，DCP 被用作纤维手性和平面外取向结果的去极化量度。尽管复杂，ECM 的 SHG-CD 和 SHG-LD 被视为平面外和平面内纤维取向的近似值，假设始终存在单个胶原手性手性。每个计算的偏振参数的图像进一步进行纹理和统计分析。纹理分析是一种众所周知的方法，通过分析相邻像素值的变化来表征组织形态33.它通常被用作分类工具，因为它能够识别人眼可能无法区分的模式34.基于分形的纹理分析已被证明可用于显微图像分析37.在这项工作中，我们将专注于灰度共生矩阵（基于 GLCM）的纹理分析。在这里，每个偏振图像由超过 400 万个像素组成。因此，为了实现纹理参数的高分辨率映射和统计调查，所有偏振图像被分为 64 个子图像（图 1c）。在所有子图像上计算了极化参数的平均值、平均绝对偏差 (MAD) 和 5 个最有用的纹理，包括对比度、相关性、熵、角二阶矩 (ASM) 和逆差矩 (IDM)表征组织中的胶原蛋白（图 1d）19.分析的最后阶段涉及机器学习辅助诊断，如图 1e 所示。为此，将正常组织和肿瘤组织的 5 个极化参数的平均值、MAD 和纹理的组合用于训练逻辑回归分类器。经过训练的分类器用于对一组独立的图像进行预测，并绘制胶原蛋白的超微结构特性图，从而区分正常组织和肿瘤组织。 科学报告|(2022) 12:10290 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13623-13图1。从成像到分类。 (一个) 由偏振态发生器 (PSG) 和偏振态分析仪 (PSA) 制备的 16 种独特偏振态组合的样品的宽场偏振 SHG 成像，分别对应于水平线偏振 (HLP)、垂直线偏振 (VLP)、分别为右圆极化状态和左圆极化状态（RCP 和 LCP）。 (b) 计算 SHG 斯托克斯矢量元素以计算极化参数图像。左图分别为 HLP、VLP、RCP 和 LCP 的 PSG 状态下 s0、s1 和 s3 分量的乳腺组织核心伪彩色图像。右图显示了 SHG 强度、R 比、DCP、SHG-CD 和 SHG-LD 的核心极化参数图。 (C) 将偏振图像细分为 64 个子图像，以进行高分辨率纹理分析和统计显着性测试。 (d）计算极化参数的均值和平均绝对偏差，以及每个子图像的对比度、相关性、熵、角二阶矩（ASM）和逆差矩（IDM）纹理参数。 (e) 使用极化和纹理参数训练逻辑回归分类器，然后进行预测以区分正常组织和肿瘤组织。 科学报告|(2022) 12:10290 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-13623-14图 2。组织微阵列的高通量宽场 P-SHG 成像。 (一个) 包含正常和三种不同肿瘤亚型的 H&E 染色乳腺组织微阵列。枚举表示分配给每个乳房组织核心的编号。正号表示雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR) 和人表皮生长因子受体 2 (HER2) 过表达，用 ER/PR/HER2 表示。 (b) 整个微阵列载玻片的圆极化 SHG 强度图像显示与肿瘤核心相关的明显低信号，除了核心 21 和 22 具有大量胶原基质。比例尺：2.5 毫米.C) 一个单幅宽场 SHG 图像，包括2048×2048 像素和面积约为670μ米×670μ米.比例尺：200 μ米. (d) 组织的放大区域，以红色矩形突出显示C显示了成像技术的高分辨率。比例尺：25μ米.组织微阵列的全玻片 P-SHG 成像。使用宽场 P-SHG 显微镜对乳房组织微阵列的胶原蛋白含量进行成像，从而产生整个乳房组织核心的图像0.6 毫米直径，无需光栅扫描。图 2a 显示了带注释的 H&E 染色的正常 (N) 和肿瘤 (T) 核心微阵列。后者以雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR) 和人表皮生长因子受体 2 (HER2) 的表达为特征，并考虑了 3 种最常见的亚型：ER+/公关+/HER2+ （三正或+/ + /+，也称为HER2阳性），ER+/公关+/ HER2−（双阳性或+/ + /−，也称为激素受体阳性）和 ER-/PR-/HER2-（三阴性或−/ − /−)38.乳房组织微阵列载玻片由来自 12 位不同患者的 45 个组织核心组成。总体而言，15 个正常核心和 20 个肿瘤核心（5 个三阴性核心、11 个双阴性核心和 4 个三阳性核心）用于进一步分析。所有岩心的 SHG 强度图像见图 2b。每个核心图像由2048×2048 像素，对应的面积