PI3K/Akt 通路介导胰岛素在 Langendorff 灌注大鼠心脏中的正性肌力作用

科学报告|(2022) 12:9793| https://doi.org/10.1038/s41598-022-14092-21 打开PI3K/Akt 通路介导正性肌力作用Langendorff 灌注大鼠心脏中的胰岛素中馆洋介1,2, Akiko Kawakami1, Hiroaki Sato3, Tamaki Sato3, Takeshi Oguchi3, Keisuke Omiya3, Toru Matsuoka1, Thomas Schricker3 & Takashi Matsukawa1胰岛素对心肌产生正性肌力作用；然而，心肌收缩力与磷酸肌醇-3-激酶/Akt (PI3K/Akt) 激活之间的关系仍不清楚。我们假设胰岛素的正性肌力作用是剂量依赖性的，并通过孤立的正常大鼠心脏中的 PI3K/Akt 途径介导。机构动物调查委员会批准使用在戊巴比妥麻醉下从大鼠身上切除的心脏。使用 Langendorff 技术在恒定压力下灌注心脏。稳定后（基线），将心脏随机分为以下四个胰岛素（Ins）组：1）Ins0（0 IU/L），2）Ins0.5（0.5 IU/L），3）Ins5（5 IU/L） L) 和 4) Ins50 (50 IU/L)（每组 n = 8）。为了阐明 PI3K/Akt 通路在胰岛素依赖性肌力作用中的作用，我们还用 PI3K 治疗了胰岛素组渥曼青霉素抑制剂 (InsW)：5) InsW0 (0 IU/L)、6) InsW0.5 (0.5 IU/L)、7) InsW5 (5 IU/L) 和 8) InsW50 (50 IU/L)。用含有或不含有渥曼青霉素的 Krebs-Henseleit 缓冲溶液灌注心脏 10 分钟，然后用含有每种浓度胰岛素的溶液灌注 20 分钟。将数据记录为压力发展的最大左心室导数 (LV dP/dt max)。在 3 分钟、5 分钟和灌注结束时测量心肌 p-Akt 水平。在 Ins 组中，与基线相比，在胰岛素灌注后 3 分钟，Ins5 和 Ins50 中的 LV dP/dt max 分别增加了 14% 和 48%。在 Ins5 和 Ins50 治疗组中 10 分钟后观察到快速反应。 Wortmannin 部分抑制胰岛素的正性肌力作用；尽管与对照组相比，胰岛素在所有时间点都提高了 p-Akt 水平，但这种增加在渥曼青霉素存在下受到抑制。胰岛素的正性肌力作用是剂量依赖性的，并且与 Akt 激活一致。这种由高剂量胰岛素对心脏组织介导的作用是暂时的，并引起快速反应，这可能是由 Akt 过度激活引起的，导致 β 1 失活。缩写方差分析方差分析过剩葡萄糖转运蛋白人力资源心率KH 克雷布斯-亨塞莱特低压左心室LV dP/dt 最大值最大 LV 压力导数 Ins0 胰岛素 0 IU/LIns0.5胰岛素 0.5 IU/LINS5胰岛素 5 IU/LINS50胰岛素 50 IU/LInsW0胰岛素 0 IU/L 和渥曼青霉素InsW0.5胰岛素 0.5 IU/L 和渥曼青霉素1山梨大学麻醉科，1110 Shimokato, Chuo-City, Yamanashi 409-3898, Japan。 2筑波大学医院麻醉科，日本茨城县筑波市天久保 2-1-1 邮编 305-8535。 3麻醉科，麦吉尔大学健康中心 Glen Site，皇家维多利亚医院 1001 Blvd, Decarie, Montreal, QC H4A 3J1, Canada。电子邮件：nakadate.yosuk e.ge@ms.hosp.tsukuba.ac.jp 科学报告|(2022) 12:9793 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14092-22InsW5胰岛素 5 IU/L 和渥曼青霉素InsW50胰岛素 50 IU/L 和渥曼青霉素PI3K/Akt磷酸肌醇-3-激酶/Akt赖氨酸Ryanodine 受体南非窦房结标清标准差塞卡肌浆网钙2+SR肌浆网许多正性肌力药物，如麻黄碱、多巴胺和多巴酚丁胺1, 发挥剂量依赖性的正性肌力作用，通常在全身麻醉下的手术中使用2.大多数这些药物刺激β受体，导致蛋白激酶A活化。然而，它们会增加心肌耗氧量，引起心律失常，并且没有心脏保护作用。因此，使用通过其他途径发挥作用的正性肌力药物将更好地进行麻醉维持。在动物模型中，胰岛素还对心肌产生正性肌力作用3.此外，据报道，高剂量胰岛素对健康志愿者的血流动力学影响6.胰岛素激活磷酸肌醇-3-激酶/Akt (PI3K/Akt) 通路，Akt 底物通过启动影响细胞功能的各个方面，包括生长、存活、增殖、代谢、葡萄糖摄取、基因表达和细胞间通讯。旁分泌和自分泌因子的产生7.胰岛素促进葡萄糖作为心脏主要能量底物的利用，可降低冠状动脉阻力和心肌耗氧量，提高心脏效率8, 而 Akt 激活钙处理9 和葡萄糖摄取8.因此，胰岛素的正性肌力作用被认为是通过 PI3K/Akt 途径介导的。然而，尚不清楚心脏收缩力和 Akt 激活是否会随着胰岛素浓度的增加而增加。因此，我们假设胰岛素可以以剂量依赖性方式激活 Akt 以介导其在心脏中的肌力作用。在本研究中，我们在离体大鼠心脏模型中评估了胰岛素浓度与 PI3K/Akt 通路介导的肌力作用之间的关系，从而可以测试不同心血管药物对冠状脉管系统、肌肉收缩和心率的影响(HR)，不受任何其他器官的干扰10.方法本研究中使用的实验方案由山梨大学动物护理委员会（协议号 A26-19）审查和批准。所有方法均按照山梨大学动物实验设施制定的“山梨大学动物实验规则”的指导方针进行。该研究是按照 ARRIVE 指南进行的。Langendorff 技术用于离体心脏灌注。雄性 Wistar 大鼠（9 周龄，300-320 g）通过腹腔注射 80 mg/kg 戊巴比妥钠进行麻醉。分离心脏并迅速浸入含有 118 mmol/L NaCl、25 mmol/L NaHCO3、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L KH2PO4、1.2 mmol/L MgSO4、 2.0 mmol 的冷改性 Krebs-Henseleit (KH) 缓冲液中 /L CaCl2、 0.5 mmol/L di-NaE-DTA 和 5.5 mmol/L 葡萄糖，4 °C。主动脉插管，逆行动脉灌注在 65 mm Hg 恒定压力下用改良的 KH 缓冲液建立。 KH 溶液用 95% O2 和 5% CO2 的混合物充氧并保持在 37 °C。一个小的乳胶球囊通过二尖瓣插入左心室并连接到压力传感器（TruWave，Edwards Lifesciences，CA，USA）以连续监测左心室（LV）压力。球囊体积充满水以维持 LV 舒张末期压力相当于 5-7 mmHg。将导管插入肺动脉以收集冠状静脉回流并测量冠状动脉流量。实验方案。实验 1 为研究胰岛素的剂量依赖性正性肌力作用，将离体大鼠心脏的 HR 和收缩力稳定 15 分钟以达到稳定的血流动力学，之后将心脏随机分配到以下四组（每组 n = 8）：1）胰岛素 0 IU/L（Ins0；对照），2）胰岛素 0.5 IU/L（Ins0.5），3）胰岛素 5 IU/L（Ins5）和 4）胰岛素- 林 50 IU/L (Ins50)。排除标准为 HR < 200 bpm、最大 LV 压力导数 (LV dP/dt max) < 2000 mmHg/s，以及稳定 10 分钟后出现多发性心律失常。实验设计如图 1 所示。心脏用 KH 缓冲液灌注 10 分钟，然后用胰岛素溶液灌注 20 分钟。在灌注前记录基线血流动力学，每个浓度从 0 分钟开始。灌注后，将整个大鼠心脏快速冷冻在液氮中并冷冻干燥 6 天，然后测量心肌中的 p-Akt。实验 2。为了阐明 PI3K/Akt 通路在胰岛素诱导的肌力作用中的作用，我们将心脏分配到以下四组（每组 n = 8），这些组接受了 PI3K 的特异性抑制剂渥曼青霉素治疗： 5) 胰岛素 0 IU/L (InsW0；对照)，6) 胰岛素 0.5 IU/L (InsW0.5)，7) 胰岛素 5 IU/L (InsW5)，和 8) 胰岛素 50 IU/L (InsW50)。在这四组中，心脏首先用含有 100 nmol/L 渥曼青霉素的 KH 溶液灌注 10 分钟，然后用不同的胰岛素浓度溶液灌注 20 分钟。灌注后，将整个大鼠心脏在液氮中快速冷冻并冷冻干燥6天。 科学报告|(2022) 12:9793 |https://doi.org/10.1038/s41598-022-14092-23图1。在离体大鼠心脏中进行胰岛素灌注的实验工作流程。在胰岛素治疗 (Ins) 组中，心脏用含有 5.5 mmol/L 葡萄糖的 Krebs-Henseleit (KH) 缓冲液灌注 10 分钟，然后用每种浓度的胰岛素灌注 20 分钟（实验 1）。在胰岛素加渥曼青霉素治疗 (InsW) 组中，用含有 KH 缓冲液的心脏灌注 10 分钟100 nmol/L 渥曼青霉素和 5.5 mmol/L 葡萄糖以及每种浓度的胰岛素（实验 2）。然后用每种浓度的胰岛素溶液对心脏灌注 20 分钟，并取样用于 p-Akt 测量（实验 1 和 2）。在每种实验性灌注液给药后 0、3、5、10、15 和 20 分钟测量 HR 和左心室压力发展导数 (LV dP/dt)，并且在 0、5、10、15 和 20 分钟后测量冠状动脉流出物和氧分压（实验 1 和 2）。在胰岛素或对照溶液给药的 3 分钟和 5 分钟时对整个心脏肌肉进行采样以测量 p-Akt（实验 3）。实验 3。为了测量胰岛素或对照溶液给药 3 分钟和 5 分钟时的 p-Akt 值，使用上述技术对整个心脏肌肉（每组 n = 8）进行采样以进行 p-Akt 测量（图1).测量。在心脏灌注期间连续记录 HR (bpm) 和 LV dP/dt max (mmHg/s)。冠状动脉血流 (CF) 是通过在基线时以及在胰岛素灌注之前（对照）和 5、10、15 和 20 分钟之后从插入肺动脉的导管中定时收集灌注液来测量的。使用血气分析仪（iSTAT1 分析仪；雅培，日本，东京）测量氧分压。使用 Neely 等人描述的公式计算耗氧量。11.耗氧量 (mmol/h/g) = ((动脉-静脉氧分压) (mm Hg) / 760 (mm Hg)) × 37 °C 时氧气的溶解度 (ml/ml H2O) / 22.4 [ml/mmol] ) × (CF [ml/h] / 心脏干重 [g])。将冷冻干燥的心肌悬浮在含有苯甲磺酰氟 (2 mM, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) 的分析裂解缓冲液 (Lysis Buffer 6, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 中和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich, Inc.）。使用微型均质系统（MicroSmash MS-100R，TOMY SEIKO Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）对样品进行均质化，并以 2000 × g 离心匀浆 5 分钟12.使用酶联免疫吸附测定法（[pSer）测定上清液中的 p-Akt473/474] Akt1/2，恩佐，法明代尔，纽约，美国）。 p-Akt 的浓度用分光光度法（Spectra Max 340, Molecular Devices, Sunnydale, CA, USA）在 450 nm 处进行定量。波长校正设置为 540 nm。这些值表示为每克心脏干重的毫克 p-Akt。统计分析。数据表示为平均值±标准偏差 (SD)。使用单因素方差分析 (ANOVA) 对基线测量值（例如血流动力学数据和心脏干重）进行组间比较。使用重复的双向 ANOVA 和事后 Bonferroni 检验分析血流动力学和 p-Akt 浓度的变化。两侧 P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。样本量计算基于组间收缩力的预期